Survivin在胃癌組織中的表達及其與幽門螺桿菌感染的關系

焦建新++++++溫風霞++++++張玲玲++++++焦東晟++++++李蕾++++++季萬勝++++++馮玉光++++++張小茜

[摘要] 目的 探討胃癌組織中Survivin的表達與臨床病理因素及其與幽門螺桿菌（H.pylori）感染之間的關系。 方法 采用免疫組織化學方法檢測60例胃癌組織中Survivin的表達情況；采用快速尿素酶法及Warthin-Starry銀染色法檢測60例胃癌組織中的H.pylori感染情況。分析Survivin表達與各臨床病理因素及H.pylori感染的關系。所有患者隨訪至少5年或直到死亡。 結果 60例胃癌組織中Survivin表達陽性率為68.3%，腫瘤侵及固有肌層組（77.8%）和漿膜層組（60.0%）Survivin的表達高于腫瘤局限于黏膜及黏膜下層組（44.4%），差異有統計學意義（P<0.05）；低分化組Survivin的表達高于中高分化組（81.8%比55.6%，P<0.05）；Survivin陽性表達率在有淋巴結轉移的胃癌組織中明顯高于無淋巴結轉移的胃癌組織（80.4%比44.4%，P<0.05）；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織Survivin表達的陽性率明顯高于Ⅰ/Ⅱ期（86.5%比56.5%，P<0.01）；Survivin表達陽性患者5年生存率明顯低于表達陰性患者（39.0%比63.2%，P<0.05）；Survivin陽性表達率在H.pylori陽性胃癌組織中明顯高于H.pylori陰性胃癌組織（75.6%比46.7%，P<0.05）。 結論 Survivin的表達與胃癌的發生、發展有關，可作為判斷胃癌預后的一個客觀指標；H.pylori感染能夠促進Survivin的表達。

[關鍵詞] 胃腫瘤；Survivin；幽門螺桿菌；免疫組織化學

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（a）-0004-05

Relationship between Survivin expression and Helicobacter pylori infection in gastric cancer

JIAO Jian-xin1 WEN Feng-xia1 ZHANG Ling-ling2▲ JIAO Dong-sheng1 LI Lei1 JI Wan-sheng1 FENG Yu-guang1 ZHANG Xiao-qian1

1.Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Weifang Medical University，Shandong Province，Weifang 261031，China；2.Department of Oncology，Binzhou People′s Hospital，Shandong Province，Binzhou 256610，China

[Abstract] Objective To explore the relationship between Survivin expression and the clinicopathologic parameters of Helicobacter pylori （H.pylori） infection in gastric cancer. Methods In 60 patients with gastric cancer，expression of Survivin was detected by immunohistochemistry，H.pylori infection was determined by Warthin-Starry staining and rapid urease test.All the cases were followed up at least 5 years or until death.The relationship between Survivin expression and the clinicopathologic parameters，H.pylori infection was respectively analyzed. Results The positive rate of Survivin was 68.3% （41/60） in 60 patients with gastric cancer.The positive rate of Survivin in cases limited to muscularis and serosa was higher than that of Survivin in cases limited to mucosa and submucosa （77.8%，60.0%，44.4%，P<0.05）.Survivin expression rate was higher in poorly differentiated group than that in well differentiated one （81.8% vs 55.6%，P<0.05）.The positive rate of gastric cancer with lymph node metastasis was higher than that of gastric cancer without lymph node metastasis （80.4% vs 44.4%，P<0.05）.The positive rate of Ⅲ/Ⅳ stage gastric cancer was higher than that of Ⅰ/Ⅱ stage （86.5% vs 56.5%，P<0.01）.Five-year survival rate in Survivin positive cases was lower than that in Survivin negative cases （39.0% vs 63.2%，P<0.05）.The positive rate of positive H.pylori infection gastric cancer was higher than that of negative H.pylori infection gastric cancer （75.6% vs 46.7%，P<0.05）. Conclusion Suvivin expression is related with the occurrence and development of gastric cancer，a detection of the expression may be used as an objective index for predicting the prognosis of this disease.H.pylori infection can promote Suvivin expression.

[Key words] Stomach Neoplasms；Survivin；Helicobacter pylori；Immunohistochemistry

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，胃癌的發生發展與細胞的增殖凋亡密切相關。Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）成員之一，是迄今為止最強的凋亡抑制因子，Survivin不但能抑制腫瘤細胞的凋亡，而且還參與腫瘤新生血管的形成。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要病因，亦與胃癌的發生有關。本研究采用免疫組化法檢測Survivin在胃癌組織中的表達，探討其表達與胃癌臨床病理特征之間的關系及患者術后5年生存率之間的關系，并分析其與H.pylori感染的關系，闡明Survivin在胃癌發生發展中的作用及機制，為從分子水平進一步研究胃癌的發生發展、預后和治療尋求新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60例胃癌組織標本取自我院2008年1～12月收治的胃癌患者，患者均采取胃癌根治術治療，患者術前均未接受放療、化療或其他針對胃癌的特殊治療。其中男39例，女21例；年齡43～80歲，平均58.7歲；胃癌位于胃底10例，胃體16例，胃竇34例；胃癌局限于黏膜及黏膜下層9例，侵及肌層15例，漿膜層36例；乳頭狀腺癌15例，管狀腺癌34例，黏液癌6例，印戒細胞癌3例，未分化癌2例；高分化4例，中分化23例，低分化27例，未分化6例；有淋巴結轉移51例，無淋巴結轉移9例；7例有肝轉移，53例無肝轉移。依據1997年IUCC分期標準進行TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期14例，Ⅲ期23例，Ⅳ期14例。

1.2 方法

采用免疫組織化學S-P法，操作步驟參照試劑盒說明書，每次實驗用PBS代替一抗作為陰性對照，已知胃癌切片作為陽性對照。H.pylori采用快速尿素酶法及Warthin-Starry染色法檢測，兩者均陽性則判定為H.pylori感染陽性。其中實驗用兔抗人Survivin多克隆抗體購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 免疫組織化學染色結果判定標準

由兩位不了解患者病情的病理醫師獨立進行判定評分。

1.3.1 依據切片中細胞的染色程度進行評分 無著色：0分；呈淺黃色：1分；呈棕黃色：2分；呈棕褐色：3分。

1.3.2 依據陽性細胞比例進行評分 每例隨機觀察5個視野，每個視野100個細胞，計數500個細胞中染色陽性的細胞數。染色細胞數占<5%：0分；染色細胞數占5%～25%：1分；染色細胞數占26%～50%：2分；染色細胞數占51%～75%：3分；染色細胞數占>75%：4分。

1.3.3 最終評分 以上述兩種評分的乘積作為最終評分，≥2分為陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計數資料的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，用Log-rank法比較兩組之間生存曲線的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌和癌旁正常胃黏膜組織中Survivin的表達

胃癌組織中Survivin主要定位于癌細胞胞質內，表現為粗細不均的棕黃色顆粒，其陽性率為68.3%（41/60）（圖1），在癌旁正常胃黏膜組織中Survivin幾乎不表達（圖2），兩者差異有統計學意義（P<0.01）。

圖1 胃癌組織中Survivin的陽性表達（SP，×400）

圖2 正常胃黏膜組織中Survivin的陰性表達（SP，×100）

2.2 Survivin表達與胃癌臨床病理特征之間的關系

Survivin表達與胃癌患者的年齡，性別，腫瘤大小、位置，組織類型無關，而與腫瘤浸潤深度、組織分化程度、有無淋巴結轉移及TNM分期相關（表1）。

2.3 Survivin表達與胃癌預后的分析

60例胃癌患者隨訪至少5年或到其死亡，共28例存活，5年總體生存率為46.7%；Survivin陽性患者存活16例，生存率為39.0%（16/41）；Survivin陰性患者存活12例，生存率為63.2%（12/19）。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線（圖3），Log-rank檢驗兩者差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 Survivin表達與H.Pylori感染的關系

60例胃癌患者中H.Pylori陽性45例，H.Pylori陽性患者中Survivin陽性率為75.6%（34/45），H.Pylori陰性患者中Survivin陽性率為46.7%（7/15），兩者差異有統計學意義（χ2=4.225，P<0.05）。

3 討論

Survivin是由Ambrosini等[1]于1997年發現的一種新的IAPs，是迄今為止克隆出的最小的IAPs成員，全長14 700 bp，該基因定位于17q25，可編碼生成分子質量為16.2 kD、由142個氨基酸構成的蛋白。Survivin是已知的最強的凋亡抑制因子[2]，能抑制由Bax、Fas等介導的下游反應，可阻止caspase活化，抑制caspase-3、caspase-7等高表達所誘導的細胞凋亡[3-4]。Survivin能與細胞周期調控因子CDK4形成復合體，使p21從中釋放出來，p21再與caspase-3結合，抑制其活性，阻止凋亡[5]。Survivin能參與調節細胞的有絲分裂，Survivin僅在G2/M期表達，是細胞周期中G2/M期的調節基因。Survivin具有同源二聚體的獨特分子結構，其氨基端有一個交織螺旋結構，該結構是與紡錘體微管蛋白相結合的位點，若干擾Survivin與之結合，則其抗凋亡功效下降，使細胞逃避G2/M期的監控，導致細胞異常分裂增殖，進而產生腫瘤。因此，Survivin具有抑制凋亡和調控細胞分裂的多重功效，與腫瘤的發生、發展密切相關[6-7]。

Survivin表達與細胞增殖有關，有細胞增殖的組織均有Survivin的表達。Survivin在正常成人已分化的組織中不表達，而在腫瘤組織中均有不同程度的表達，諸如食管癌、胃癌、肝癌、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、膀胱癌等，表達率為30%～100%，而且Survivin的表達與腫瘤患者的臨床病理特點有關[8]。不同的腫瘤組織Survivin的表達不盡相同，可能與Survivin的不同結構形式和作用機制有關。有關Survivin在大腸癌中的表達與腫瘤臨床病理特征的關系的報道不盡一致。Hernandez等[9]報道Survivin在結腸癌中高表達，而在正常組織中無表達。Dukes C期、Dukes D期陽性率高于Dukes A期、Dukes B期。Survivin陽性大腸癌患者5年生存率明顯低于Survivin陰性患者。Survivin表達與腫瘤大小、侵襲深度、淋巴結轉移及分化程度無明顯關系。同樣，Survivin在胃癌中的表達與臨床病理特征的關系亦不盡一致，Stauber等[10]研究顯示，Survivin基因表達強度與胃癌患者臨床分期、組織分化程度及淋巴結轉移有關，胃癌患者的臨床分期越晚、組織分化惡性程度越高，其Survivin表達的陽性率就越高。Lu等[11]報道Survivin在胃癌中的表達率為34%，且其表達與胃癌患者的病灶大小、侵襲深度、組織學類型以及淋巴管浸潤有關。然而，Miyachi等[12]報道Survivin mRNA表達與胃癌組織學類型及侵襲深度無明顯關系，但與是否存在淋巴結轉移有關，發生淋巴結轉移者Survivin mRNA陽性率高，提示Survivin mRNA表達可出現在胃癌早期階段，其可作為判斷胃癌發生淋巴結轉移可能性大小的依據。

為進一步明確Survivin與胃癌患者臨床病理特征之間的關系，本研究采用免疫組織化學法檢測Survivin在胃癌組織中的表達，并探討其表達與臨床病理特征之間的關系。研究表明，Survivin在正常胃組織中的表達呈陰性，而在胃癌組織中呈現高表達，其陽性率為68.3%。Survivin表達主要位于胃癌細胞質內，細胞核中未見陽性表達，癌旁組織也未見陽性表達，這與相關文獻的報道大致相同[13]。Survivin在胃癌組織中的表達與性別、年齡、腫瘤大小、位置及組織類型無明顯相關性（P>0.05）；與腫瘤侵襲深度、組織分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關（P<0.05）。腫瘤侵襲越深，Survivin陽性率越高；有淋巴結轉移者陽性率高于無淋巴結轉移者；低/未分化組陽性率高于高/中分化組；TNM Ⅲ/Ⅳ期患者陽性率高于TNM Ⅰ/Ⅱ期。由此可見Survivin不僅在胃癌的發生、發展中起重要作用，而且可能參與了癌細胞的轉移過程，以上臨床病理特點使Survivin可成為輔助腫瘤診斷、判斷患者預后的一項重要指標，亦為腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點[14]。其作用機制可能在于Survivin對腫瘤新生血管形成具有重要作用。腫瘤生長、轉移離不開豐富的血液供應，即需要有不斷的新生血管形成。新生血管形成是內皮細胞增殖與凋亡相平衡的結果。應用血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子及血管形成素-1等刺激內皮細胞，可誘導內皮細胞Survivin表達，而炎癥因子、TNF-α、IL-1等未能誘導其表達，提示Survivin能維持內皮細胞增殖，其凋亡明顯受到抑制，從而導致新生毛細血管網的形成[15]。血管形成素-1是內皮細胞的特異性配體，是維持血管穩定和管腔形成的關鍵因子，但其作用需依賴Survivin表達上調，故Survivin在血管形成中具有重要意義，對腫瘤的浸潤、轉移可能發揮關鍵性作用[16]。

Survivin表達與腫瘤預后可能存在相關性，Sarela等[17]報道Survivin陽性結腸癌根治性切除術術后5年生存率為53.0%，Survivin陰性患者則達77.7%，Survivin陽性結腸癌術后復發率及復發后病死率均顯著高于Survivin陰性患者，故認為Survivin為腫瘤預后不良的獨立危險因素。Hoffmann等[18]亦報道，通過檢測外周血中Survivin mRNA的表達可判定手術切除胃腸道腫瘤的療效，術前Survivin mRNA的陽性率為88%，術后降為59%，認為Survivin mRNA可成為手術切除是否完整及預后的一個分子標志物。Okada等[19]研究顯示Survivin在胃癌細胞中的陽性率為82%，Survivin陽性患者的5年生存率為30.56%，Survivin陰性患者達58.49%，可見Survivin表達與胃癌患者生存率相關。本研究結果也顯示，Survivin陽性患者5年生存率為39.0%，Survivin陰性患者則為63.2%，Log-rank檢驗兩者差異有統計學意義（P<0.05），提示Survivin陽性患者預后不良，故Survivin可成為一個判斷胃癌患者預后的重要的新的客觀指標[20-21]。

現已確認H.pylori感染是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要病因，與胃癌的發生也有密切關系，被認為是胃癌的重要致病因素之一，1994年WHO宣布H.pylori是胃癌的Ⅰ類致癌原。H.pylori是一種革蘭氏陰性微需氧菌，機體感染后難以自行將其殺滅清除，能長期定植于胃黏膜上皮細胞層。一方面，H.pylori憑借其產生的多種毒素和酶，損害黏膜的防御/修復機制；另一方面，H.pylori感染可導致高胃泌素血癥，使胃泌素和胃酸分泌增加。這兩方面共同作用造成了胃黏膜的慢性炎癥，若炎癥持續進展則導致黏膜腺體破壞、數量減少而發生慢性萎縮性胃炎，此時胃黏膜細胞內已發生了某些基因的異常表達，但尚處于量變階段，屬于癌前病變。病變若繼續發展可引起腸化生和不典型增生，最終可演變成胃癌，故H.pylori感染在慢性萎縮性胃炎和胃癌的病因學上起重要作用。胃黏膜慢性炎癥，歷經萎縮、腸化生、不典型增生，最終演變成胃癌，這是由慢性炎癥導致腫瘤的代表性模型之一。本實驗顯示Survivin 陽性率在H.pylori陽性胃癌組織中高于H.pylori陰性胃癌組織（P<0.05），說明Survivin在胃癌組織中的表達與H.pylori感染有關，兩者在胃癌的發生中可能起協同作用，其作用機制可能為H.pylori可產生尿素酶、黏液酶、脂酶、磷脂酶A、脂多糖、細胞毒素CagA等有害因子，能引起胃黏膜上皮細胞的損傷，上皮細胞可產生IL6、IL-8、TNF-α等，它們不僅具有免疫抑制作用，尚可促進腫瘤的形成、生長和轉移；H.pylori能破壞細胞的周期調節，誘導細胞凋亡及導致細胞周期阻滯。H.pylori能通過絲裂原活化蛋白激酶途徑使周期素D1激活，使其高表達，引起細胞周期改變而致增殖加速，從而導致腫瘤的發生；H.pylori還可引起細胞DNA的損傷及基因突變，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活等，如H.pylori可使原癌基因c-met高表達，也可使抑癌基因p53突變、失活，而c-met高表達與胃黏膜增殖和惡化有關，p53等在胃癌的發生和發展中亦起重要作用。H.pylori可能通過上調胃癌組織中Survivin的表達，抑制癌細胞凋亡，促進癌細胞生長。另外，根除H.pylori感染可減輕胃黏膜活動性炎癥，阻止或延緩萎縮和腸化生，進而有利于減少胃癌的發生。由于腫瘤的發生是一個多基因、多步驟、多因素參與的漫長演變過程，各種因素的相互作用共同決定了腫瘤的發生、發展和預后。所以，Survivin和H.pylori感染在胃癌的發生、發展中可能起協同作用，但其具體的作用機制尚待進一步研究[22]。

由于在日常臨床工作中，所診治的患者大多已屬于中晚期胃癌，而中晚期胃癌手術、化療、放療等療效均不甚理想，因此采用基因療法治療胃癌就被提上日程。鑒于胃癌組織中Survivin表達具有較高的特異性，使得Survivin可以成為腫瘤靶向治療的新靶點[23]，在臨床工作中采用靶向方式治療胃癌也就成為了可能。借助檢測胃癌組織中Survivin的表達，即可為胃癌的臨床靶向治療提供依據。

綜上所述，Survivin在胃癌組織中呈高表達，其表達與胃癌的臨床病理因素有關，對胃癌的發生發展和預后判斷是一種頗有價值的客觀的參考指標，亦可成為一種新的腫瘤基因診斷的標志物和腫瘤靶向治療的靶點。H.pylori感染能夠促進Survivin的表達，兩者在胃癌的發生、發展中可能起協同作用，共同導致了胃癌的發生、發展。

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（收稿日期：2015-10-30 本文編輯：衛 軻）