重組人促紅細胞生成素治療腎間質纖維化的作用機制研究

江羅佳，秦曉華，黃 翀，房向東，涂衛平

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·論著·

重組人促紅細胞生成素治療腎間質纖維化的作用機制研究

江羅佳，秦曉華，黃 翀，房向東，涂衛平

【摘要】目的探討重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)治療腎間質纖維化(RIF)的作用機制。方法2014年7月—2015年6月，將人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)隨機分為7組：空白對照組(E1組)：未加任何刺激物；rHuEPO對照組(E2組)：rHuEPO終濃度為20 U/ml；人純化清蛋白誘導組(E3組)：人純化清蛋白終濃度為5 mg/ml；E4組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(5 U/ml)；E5組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(10 U/ml)；E6組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(20 U/ml)；Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)抑制劑Y27632組(E7組)：加ROCK抑制劑Y27632(10 μmol/L)，30 min后加人純化清蛋白(5 mg/ml)。采用細胞增殖試驗檢測刺激16、24、48、72 h時各組細胞增殖數，反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測RhoA、ROCK mRNA表達水平，細胞免疫熒光法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達水平，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測纖維連接蛋白(FN)表達水平。結果16 h時，各組細胞增殖數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。24、48、72 h時，各組細胞增殖數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E7組低于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組(P<0.05)。各組RhoA mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。各組ROCK mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。各組α-SMA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。各組E-cadherin表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組低于E1組、E2組，E4～E7組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組(P<0.05)。各組FN表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組(P<0.05)。E3組、E4組、E5組、E6組RhoA mRNA與ROCK mRNA均呈正相關(P<0.05)。結論人純化清蛋白能誘導HK-2細胞發生上皮細胞-間充質細胞轉分化(EMT)，進而發生RIF，而rHuEPO通過阻斷EMT的RhoA/ROCK信號轉導通路從而抑制RIF發生，且在一定范圍內rHuEPO水平越高，其抑制作用越強。

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是逐步進展成慢性腎衰竭的一個必經之路。探討一種新的、針對性的治療方案，阻斷甚至逆轉RIF的進展，在延緩慢性腎臟病進展中顯得尤其重要。在RIF過程中，腎小管基底膜損害的同時常伴有腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞樣細胞轉分化，這種現象被稱作“上皮細胞-間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)”，各種細胞因子、生長因子、激素等均參與并協同完成EMT過程[1-3]。近幾年，有學者認為，在EMT過程中，RhoA/Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protein kinase，ROCK)與轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)/smads是2條并行的信號轉導通路[4-5]。本研究旨在探討重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)的腎臟保護生物學效應是否與抑制RhoA/ROCK信號轉導通路有關，為進一步深入研究RIF機制提供科學依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞來源人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)株來源于美國組織培養物細胞庫(ATCC)。

1.1.2主要試劑DMEM/F12培養基(美國HyClone公司)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，人純化清蛋白(成都雙流正龍生化制品研究室)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)(南京森貝伽生物科技有限公司)，rHuEPO(沈陽三生制藥股份有限公司惠贈)，總RNA抽提試劑(Trizol)(美國Invitrogen公司)，反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒(美國Fermentas公司)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)，鼠抗人單克隆α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ROCK抑制劑Y27632(美國Sigma公司)。

1.1.3主要儀器PCR擴增儀、Gel DocXR凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，DYPC-31DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)，全自動酶標儀(美國Thermo公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus)，5% CO2培養箱(美國Thermo公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及實驗分組2014年7月—2015年6月，取凍存于液氮中的HK-2細胞，立刻投入37 ℃溫水中解凍，1 500 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，吹打使得細胞沉淀混懸，接種于無菌培養瓶中，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，2 d換液1次，當顯微鏡下觀察細胞融合至80%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將HK-2細胞隨機分為7組：空白對照組(E1組)：未加任何刺激物；rHuEPO對照組(E2組)：rHuEPO終濃度為20 U/ml；人純化清蛋白誘導組(E3組)：人純化清蛋白終濃度為5 mg/ml；E4組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(5 U/ml)；E5組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(10 U/ml)；E6組：加人純化清蛋白(5 mg/ml)和rHuEPO(20 U/ml)；ROCK抑制劑Y27632組(E7組)：加ROCK抑制劑Y27632(10 μmol/L)，30 min后加人純化清蛋白(5 mg/ml)。

1.2.2細胞增殖試驗檢測細胞增殖數采用MTT法進行細胞增殖試驗。收集各組對數期HK-2細胞，往96孔板每孔中加入100 μl細胞懸液，鋪板將待測細胞密度調到2 000/ml，邊緣孔以無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)填充，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養24 h，然后分別往各組加入刺激物，100 μl/孔，每組設5個復孔，同時設置調零孔〔只加入DMEM/F12培養基、MTT、二甲基亞砜(DMSO)〕和對照孔(只加入細胞、相同濃度藥物溶解介質、含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基、MTT、DMSO)；繼續置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養16 h，棄板中培養液，小心用PBS沖洗2～3遍，每孔加100 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h；棄去各組孔內培養液，每孔加100 μl DMSO，放置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解；最后在酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測儀490 nm處檢測各組的吸光度(OD值)，即細胞增殖數。記錄刺激16、24、48、72 h時各組細胞增殖數。實驗共重復3次，取平均值。

1.2.3RT-PCR法檢測RhoA、ROCK mRNA表達水平用Trizol分別提取各組HK-2細胞總RNA，取總RNA 1.5 μg反轉錄合成cDNA，取cDNA 2 μl在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下擴增目標基因(以人β-actin為內參照)，總反應體系50 μl。PCR引物由美國Invitrogen公司設計，如下：RhoA(356 bp)：上游引物為5′-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3′，下游引物為5′-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3′；ROCK(293 bp)：上游引物為5′-TGATGGCTATTATGGACGAG-3′，下游引物為5′-GGAGCGTTTCCCAAGC-3′；β-actin(443 bp)：上游引物為5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。擴增條件：94 ℃預變性2～5 min，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32～33個循環，最后72 ℃終延伸2 min。最后配制2%瓊脂糖凝膠，PCR擴增產物在120 V DYPC-31DN型電泳儀上電泳30 min，Gel DocXR凝膠成像系統成像并使用Quantity One軟件分析RhoA、ROCK mRNA表達水平。實驗共重復3次，取平均值。

1.2.4細胞免疫熒光法檢測α-SMA、E-cadherin表達水平收集96孔板中的各組HK-2細胞，于4 ℃冰箱中采用4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min，0.1% 曲拉通(Triton)穿孔15～20 min，5%胎牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉30 min，滴加鼠抗人單克隆α-SMA抗體或鼠抗人單克隆E-cadherin抗體(用5% BSA以1∶200濃度稀釋)，4 ℃冰箱孵育過夜，次日先取出置室溫30 min復溫，再加入FITC標記抗小鼠 IgG二抗(用5% BSA以1∶500濃度稀釋)，置37 ℃恒溫震蕩箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。每組細胞隨機選取10個視野(×200)攝像，熒光圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個視野累計光密度值與測量面積的比值為平均熒光強度(即蛋白相對表達水平)。實驗共重復3次，取平均值。

1.2.5ELISA法檢測纖維連接蛋白(FN)表達水平收集各組HK-2細胞上清液，嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作，記錄全自動酶標儀波長為450 nm處的OD值，繪制標準曲線，根據標準曲線方程分別求出各組FN表達水平。實驗共重復3次，取平均值。

2結果

2.1細胞增殖數比較16 h時，各組細胞增殖數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。24、48、72 h時，各組細胞增殖數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E7組低于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2RhoA、ROCK mRNA表達水平比較各組RhoA mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統計學意義(P<0.05)。各組ROCK mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖1、表2)。

Table 1　Comparison of the number of proliferating cells among the 7 groups

組別16h24h48h72hE1組0.570±0.0241.177±0.0141.234±0.0151.322±0.012E2組0.569±0.0321.171±0.0131.225±0.0131.236±0.005E3組0.586±0.0161.487±0.022ab1.556±0.004ab1.635±0.018abE4組0.584±0.0151.552±0.009abc1.682±0.003abc1.724±0.021abcE5組0.590±0.0211.722±0.015abcd1.855±0.024abcd1.883±0.018abcdE6組0.603±0.0181.775±0.017abcde1.923±0.007abcde1.964±0.025abcdeE7組0.579±0.0511.383±0.007c1.412±0.015c1.534±0.014cZ(u)值3.252.38f2.47f2.96fP值0.6750.0360.0290.021

注：與E1組比較，aP<0.05；與E2組比較，bP<0.05；與E3組比較，cP<0.05；與E4組比較，dP<0.05；與E5組比較，eP<0.05；f為u值

注：ROCK=Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶

圖1瓊脂糖凝膠電泳結果

Figure 1Results of agarose gel electrophoresis

Table 2Comparison of the expression levels of RhoA mRNA and ROCK mRNA levels among the 7 groups

組別RhoAmRNAROCKmRNAE1組0.214±0.0020.171±0.001E2組0.209±0.0010.171±0.003E3組0.653±0.002ab0.780±0.001abE4組0.524±0.004abc0.648±0.002abcE5組0.407±0.003abcd0.522±0.004abcdE6組0.261±0.005abcde0.285±0.002abcdeE7組0.591±0.0010.180±0.003cF值2723.6924353.18P值0.0310.029

注：與E1組比較，aP<0.05；與E2組比較，bP<0.05；與E3組比較，cP<0.05；與E4組比較，dP<0.05；與E5組比較，eP<0.05；ROCK=Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶

2.3α-SMA、E-cadherin表達水平比較各組α-SMA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統計學意義(P<0.05)。各組E-cadherin表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中E3～E6組低于E1組、E2組，E4～E7組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2～3、表3，本文圖2、圖3等彩圖見網站www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.4FN表達水平比較各組FN表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E7組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表3各組HK-2細胞中α-SMA、E-cadherin、FN表達水平比較

Table 3Comparison of α-SMA,E-cadherin and FN levels among the 7 groups

組別α-SMAE-cadherinFN(ng/ml)E1組0.028±0.003 0.279±0.004 6003±73E2組0.030±0.0030.268±0.002 6130±63E3組0.158±0.003ab0.006±0.002ab569073±222abE4組0.102±0.004abc0.082±0.003abc145528±353abcE5組0.062±0.002abcd0.119±0.006abcd33988±26abcdE6組0.033±0.003bcde0.245±0.005abcde 5609±86cdeE7組0.032±0.002c0.268±0.003c 7657±78cF值663.731425.47742.18P值0.0240.0420.022

注：與E1組比較，aP<0.05；與E2組比較，bP<0.05；與E3組比較，cP<0.05；與E4組比較，dP<0.05；與E5組比較，eP<0.05；α-SMA=α-平滑肌肌動蛋白，E-cadherin=E-鈣黏蛋白，FN=纖維連接蛋白

2.5相關性分析E1組、E2組、E7組RhoA mRNA與ROCK mRNA無直線相關關系(P>0.05)；E3組、E4組、E5組、E6組RhoA mRNA與ROCK mRNA均呈正相關(P<0.05，見表4)。

表4　各組RhoA mRNA與ROCK mRNA的相關性

組別相關系數(r值)P值E1組0.1140.128E2組0.3250.064E3組0.8960.021E4組0.8520.033E5組0.8640.048E6組0.8210.010E7組0.3430.074

3討論

在EMT過程中，腎小管上皮細胞并不是被動的受害者，而是擔任主導作用的角色[6]。許多臨床實踐和試驗數據顯示，RIF程度是決定慢性腎臟病預后轉歸的重要因素[1,7-9]。RhoA/ROCK信號轉導通路中的RhoA作為Ras超家族的核心成員，主要參與細胞內信號、炎性細胞的活化以及吞噬細胞的成熟、分化、遷移過程；而ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家屬，迄今發現有ROCK1和ROCK2兩類同源性非常相似的異構體存在，是目前結構、功能研究均比較明確的Rho下游序列的靶效應分子，腎臟組織中高表達ROCK1，而ROCK2主要在心臟和大腦表達[10]。Rho與其下游效應分子ROCK組成的RhoA/ROCK信號轉導通路，在體外可介導RIF中的一個重要的細胞機制，即EMT。當前，RhoA/ROCK信號轉導通路在EMT的發生、發展過程中受到廣泛關注[11-14]。在臨床工作中，使用ROCK抑制劑Y27632可以明顯改善多種器官的炎性反應，但是其藥物代謝動力學特點是分解快、t1/2短，至今尚未找到能應用于臨床的類似藥物[15]。另外一種抑制劑法舒地爾，最早應用于心腦血管疾病，其作用是舒緩平滑肌，近期發現其也是RhoA/ROCK信號轉導通路的一種選擇性阻斷劑，但目前還沒有充分證據表明其能用于RIF的治療[16]。本研究結果顯示，E7組ROCK mRNA、α-SMA、FN表達水平低于E3組，E-cadherin表達水平高于E3組，提示ROCK抑制劑Y27632能顯著減輕RIF程度，其可能通過RhoA/ROCK信號轉導通路，對EMT的發生發展起防治作用，因此阻斷該通路可能成為RIF治療的靶目標。

人促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)基因位于7號染色體長臂，包含3 000個堿基序列，編碼1條含有193個氨基酸的多肽分子，EPO在產生與分泌過程中需要經過修飾，其N端27個氨基酸的前肽與C端的精氨酸均被切除，因此機體內的活性EPO僅有165個氨基酸分子[17-18]。原味雜交大鼠在注射氯化鈷后，腎小管上皮細胞存在EPO mRNA，揭示在病理條件下腎小管上皮細胞亦可合成EPO[19]。1958年Jacobs等[20]、Kimel 等[21]首次通過基因工程技術合成rHuEPO，三十多年后才開始應用于臨床，用其治療各種慢性腎衰竭患者并發癥，此后多年中，其應用領域始終局限于免疫功能缺陷患者貧血癥狀的改善。近幾年中，隨著對EPO及其受體作用機制的不斷探討，EPO的臨床應用領域也逐步擴展，其不僅用于腎性貧血的治療，而且對其他病因導致的貧血、骨髓增生性疾病、營養不良、神經系統疾病、腦血管病變以及創傷等均具備一定療效[22-25]。本研究結果顯示，24、48、72 h時，各組細胞增殖數有差異，其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組；各組α-SMA、FN表達水平有差異，其中E3～E5組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組；各組E-cadherin表達水平有差異，其中E3～E6組低于E1組、E2組，E4～E6組高于E3組，E5組、E6組高于E4組，E6組高于E5組。提示人純化清蛋白能誘導HK-2細胞發生EMT，進而發生RIF；rHuEPO可抑制人純化清蛋白超負荷引起的EMT，延緩RIF進展，且rHuEPO水平越高，其抑制作用越強，與周媧等[26]結果相同。本研究結果亦顯示，各組RhoA、ROCK mRNA表達水平有差異，其中E3～E6組高于E1組、E2組，E4～E6組低于E3組，E5組、E6組低于E4組，E6組低于E5組，Person相關性分析結果顯示，E3組、E4組、E5組、E6組RhoA mRNA與ROCK mRNA均呈正相關。因此，筆者推測rHuEPO可能通過抑制RhoA/ROCK信號轉導通路發揮抑制EMT的腎臟保護作用，且在一定范圍內隨著rHuEPO水平增加，其抑制作用逐漸增強。

綜上所述，人純化清蛋白能誘導HK-2細胞發生EMT，進而發生RIF，rHuEPO通過阻斷EMT的RhoA/ROCK信號轉導通路而抑制RIF發生，且在一定范圍內rHuEPO水平越高，其抑制作用越強。但是，EMT的形成機制亦十分復雜，所涉及的細胞因子眾多，加之受實驗者技術水平、實驗經費等多重因素所限，本實驗僅從人純化清蛋白誘導HK-2細胞發生EMT、rHuEPO干預EMT的RhoA/ROCK信號轉導通路方面進行了初步研究。且本研究只是一次探索性研究，相信日后隨著對rHuEPO對該信號轉導通路作用機制的進一步深入探討，rHuEPO會更好地應用于臨床治療，為慢性腎臟病患者的遠期治療帶來新的曙光。

作者貢獻：江羅佳進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；秦曉華、黃翀、房向東進行實驗實施、評估、資料收集；涂衛平進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

【關鍵詞】腎疾病；細胞轉分化；重組人促紅細胞生成素；rho相關激酶類；信號傳導

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Mechanism of Recombinant Human Erythropoietin in the Treatment of Renal Interstitial FibrosisJIANGLuo-jia,QINXiao-hua,HUANGChong,etal.DepartmentofNephrology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of recombinant human erythropoietin (rHuEPO) in the treatment of renal interstitial fibrosis (RIF).MethodsFrom July 2014 to June 2015,divided the sampled human renal tubular epithelial cells (HK-2 cell) into 7 groups:E1 group (no irritants),E2 group (20 U/ml rHuEPO),E3 group (5 mg/ml purified albumin),E4 group (5 mg/ml purified albumin+5 U/ml rHuEPO),E5 group (5 mg/ml purified albumin+10 U/ml rHuEPO),E6 group (5 mg/ml purified albumin+20 U/ml rHuEPO),E7 group (5 mg/ml purified albumin 30 min after 10 μmol/L Y27632).At 16,24,48 and 72 h,the number of proliferating cells of each group was detected by cell proliferation assay;RhoA and ROCK mRNA expression levels were detected by RT-PCR;α-SMA and E-cadherin levels were detected by cell immunofluorescence method;fiber connection protein (FN) expression level was examined by ELISA method.ResultsAt 16 h,the 7 groups were not significantly different in the number of proliferating cells (P>0.05).At 24,48 and 72 h,the 7 groups were significantly different in the number of proliferating cells (P<0.05);E3-E6 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E6 groups were higher than E3 group;E7 group was lower than E3 group;E5 and E6 groups were higher than E4 group;E6 group was higher than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of RhoA mRNA (P<0.05);E3-E6 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E6 groups were lower than E3 group;E5 and E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of ROCK mRNA (P<0.05);E3-E6 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were lower than E3 group;E5 and E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of α-SMA (P<0.05);E3-E5 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were lower than E3 group;E5-E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the expression level of E-cadherin (P<0.05);E3-E6 groups were lower than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were higher than E3 group;E5-E6 groups were higher than E4 group;E6 group was higher than E5 group (P<0.05).The 7 groups were significantly different in the FN expression level (P<0.05);E3-E5 groups were higher than E1 group and E2 group;E4-E7 groups were lower than E3 group;E5-E6 groups were lower than E4 group;E6 group was lower than E5 group (P<0.05).RhoA mRNA was positively correlated with ROCK mRNA in E3,E4,E5 and E6 group (P<0.05).ConclusionPurified albumin can induce the occurrence of EMT and further induce RIF.rHuEPO can inhibit the occurrence of RIF,and its inhibitory effect improves with the increase of rHuEPO level to some extent.

【Key words】Kidney diseases;Cell transdifferentiation;Recombinant erythropoietin;rho-associated kinases;Signal transduction

(收稿日期：2015-05-03；修回日期：2015-11-26)

【中圖分類號】R 692

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.06.010

通信作者：房向東，330006 江西省南昌市，南昌大學第二附屬醫院腎內科；E-mail：xiangdongfang818@sina.com

基金項目：江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ12107)
作者單位：330006 江西省南昌市，南昌大學第二附屬醫院腎內科(江羅佳現工作于九江市第一人民醫院腎內科)