天然小分子、表象藥理與藥物作用的機制＊

雷 帆，邢東明，嚴孝金，杜力軍＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室 北京 100084；2.清華大學藥學院 北京 100084）

天然小分子、表象藥理與藥物作用的機制＊

雷 帆1，2，邢東明1，嚴孝金1，杜力軍1＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室 北京 100084；2.清華大學藥學院 北京 100084）

編者按：隨著中藥現(xiàn)代藥理研究的不斷深入，中藥復(fù)雜的藥理作用不斷被揭示和表述。中藥中一些有效小分子作為中藥的特征成分，其作用機制也不斷為人們所探索和揭示。什么是“機制”、如何深入探討中藥活性小分子的作用機制，以及在多大程度上揭示其作用機制？基于此，中藥藥理研究的思路和技術(shù)方法顯得非常重要。本專題刊登了一組由清華大學生命科學學院杜力軍教授組稿的有關(guān)中藥活性小分子藥理研究思路與方法的系列文章，嘗試對這一命題進行探討。藉此促進各位學者對中藥藥理研究現(xiàn)狀的思考、總結(jié)和提高，同時也希望該組文章對創(chuàng)新中藥小分子藥物的研究與開發(fā)有所裨益。

本文主要從天然（中藥）小分子與化學合成小分子的理念異同、表象藥理與特異性靶點及其作用機制的異同等方面對該類小分子成分的特點及其相關(guān)的藥理學研究的一些概念進行了探討。由于天然（中藥）小分子來源的非目的性，具有體內(nèi)作用靶點多樣性和作用機制廣泛性的特點。因此，在藥理研究中，要進行相關(guān)作用靶點背景的篩選，以確定作用靶點和作用機制的相關(guān)性。最后進行作用靶點和作用機制特異性的確證。為了更好的理解和掌握小分子作用的相關(guān)性和特異性，進而促進天然（中藥）小分子新藥的研究，本文對此進行了較為系統(tǒng)深入的探討。

天然藥物 小分子 表象藥理學 新藥研發(fā)

隨著中藥及天然產(chǎn)物的深入研究，一些小分子單體成分不斷被發(fā)現(xiàn)，且被開發(fā)為新藥。作為單一化合物，在確證其有效性的同時，其作用機制及其作用靶點需要進行較為清晰、深入的探討。新藥審評也強調(diào)這個問題，且需要申報、研發(fā)單位表述所申報中藥（天然）小分子的作用機制及靶點。人們常把篩選到的可能作用靶點、可能的作用機制與已確認的作用靶點、機制相混淆，不利于對研究對象的正確表述。因此，正確定義中藥（天然藥物）新藥小分子確切作用靶點、機制，準確客觀地表述，以及區(qū)分其與化學合成小分子在作用機制尤其是作用靶點上的不同點，將有助于深化對中藥（天然）小分子藥理作用的認識和研究。

1 天然小分子來源及其特征

天然小分子（Natural Small Molecules）是指非人工合成的小分子化合物，凡是從自然界生物中分離得到的單體化合物均屬此類范疇。在國家食品藥品監(jiān)督管理局新藥申請注冊分類中常歸為一類新藥。這類小分子不同于化學合成小分子，尤其在新藥研發(fā)理念上不完全一致。首先，這類小分子是自然界天然存在的，其可能產(chǎn)生的藥理作用及相關(guān)靶點具有不確定性和未知性。而化學合成小分子，因研究前期的藥物設(shè)計及有針對性的篩選，最后確定的一般是針對確定靶點具有較強生物效價的化合物。化學合成小分子一旦確定其成藥性，它的作用靶點基本上是清晰且特異的，而天然小分子對機體的作用未知，靶點也不確定。因此，在天然小分子的作用靶點探究上須首先有一個相關(guān)背景篩選，之后再確定特異性靶點。

2 藥物作用的表象與機制

表象（Phenotype）簡單來講就是指表面現(xiàn)象。一種體內(nèi)的病理、生理變化的外在反映可以稱之為相關(guān)的表象[1-3]。對藥物來說，就是給藥后受試體由此而表現(xiàn)出來的反應(yīng)[4，5]。主要以觀察所給藥物在體內(nèi)反應(yīng)所表現(xiàn)的藥效及其相應(yīng)指標變化的藥理工作，也稱之為“表象藥理”（Phenotype Pharmacology）[6-8]。藥理研究中的活性篩選，藥效確證等都屬于這一范疇。表象研究只強調(diào)機體反應(yīng)的客觀性、準確性及其相關(guān)性，但這種反映的內(nèi)在的機制不一定清楚。例如，給予一種藥物后，機體會有響應(yīng)，表現(xiàn)在某些指標或者是靶點的變化。表象所得出來的結(jié)果對受試藥物來說、反映的是“相關(guān)性”（Correlation）。由于這種指標的變化是在施加某一藥物后所表現(xiàn)出來的一系列指標變化簡單歸納的結(jié)果，只是反映了藥物作用機制的相關(guān)性，由此表述為該藥物作用的相關(guān)機制。

藥物的作用機制（Action Mechanism）指受試藥物作用機體所出現(xiàn)相關(guān)藥效的原因，而這一原因是專屬性的（Specificity）。也就是說，這些變化與藥效有因果關(guān)系（Logical Causal Relation；Logical Cause-Effect）。

表象與特異性靶點的區(qū)別在于，前者僅反映了相關(guān)性，而后者則是從邏輯關(guān)系上進行了因果確證。因此，后者是真正的反映了受試藥物的作用機制。但是由于探討因果關(guān)系的難度遠遠大于對一些結(jié)果的描述，因此多數(shù)情況下的藥理研究報告采用表象方式進行描述。如果這種表象結(jié)果與實質(zhì)的因果機制的相關(guān)性很大時，這種表象結(jié)果就具有重要的意義。

由此可見，由于表象結(jié)果與邏輯因果關(guān)系的結(jié)果有著本質(zhì)的不同，因此我們在表達某受試藥物的作用機制時一定要表達清楚是相關(guān)性，還是因果性。

由此可以看出，表象藥理的關(guān)鍵在于所觀察指標與藥物作用機制之間的相關(guān)性的大小及其權(quán)重，即其所觀測的指標與被研究對象自身運動規(guī)律之間的相關(guān)性的大小成為該受試藥物作用機制的關(guān)鍵。也就是說，所測指標距離被研究對象的自身運動規(guī)律越近，該指標所能反映受試藥物的作用機制的權(quán)重就越大，反之則越小。表象藥理所觀測指標的權(quán)重如圖1所示。

圖1 表象藥理觀測指標與藥物作用機制之間關(guān)系

系統(tǒng)藥理學（Systems Pharmacology）[9-11]或者網(wǎng)絡(luò)藥理學（Network Pharmacology）強調(diào)從整體和系統(tǒng)來表述藥物作用的靶點和機制[12-14]。其中也存在一個表象還是特異作用機制的區(qū)別。由于這兩種表述所涉及的靶點較多，進行因果關(guān)系上的驗證難度較大，因此這兩種論述多屬于表象描述。

表象藥理研究需要注意測試指標的選擇。常出現(xiàn)的問題是研究者的主觀性、指向性，即只觀察研究者想要的指標，忽視問題背后的其它因素指標（將此稱為“背景指標”，Background）。例如，觀察一個腫瘤的新指標，并指向性的認為這一指標就是受試藥物的作用靶點，而不去觀察一般與抗癌活性密切相關(guān)的諸如腫瘤壞死因子（TNFα）和凋亡壞死因子（Caspase3）等抗腫瘤的背景指標。而實際上，這一受試藥物對腫瘤的抑制作用很大一部分可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

除此之外，表象藥理研究還要分析所觀察指標之間的內(nèi)在邏輯關(guān)系，分析受試藥物是作用于這一信號通路的上游，還是同時作用于這一信號通路的各個環(huán)節(jié)。如果我們選擇單一因子作用觀察受試藥表象藥理指標，為了證明作用這一因子的有效性，我們還要再選擇該因子的下游指標同時進行觀察，以反映作用于該因子的有效性。例如，觀察中藥小分子黃芩苷對模式識別受體TLR2/4的作用，在觀察該指標表達的同時，需選取該受體下游的能反映相關(guān)效應(yīng)的因子同時觀察。由于TLR2/4都可以影響到TNFα表達，后者又反映了TLR表達后通過TNFα所激活的免疫炎性反應(yīng)。結(jié)果表明，黃芩苷不僅抑制TLR2/4的表達，并由此抑制了TNFα的表達，因而表現(xiàn)出了抗炎免疫作用。如此，這種表象藥理的研究就具有內(nèi)在邏輯性[15]。

3 表象藥理與藥效學

藥效學始終是新藥研究的核心，在確認有效性方面具有重要意義。國家食品藥品監(jiān)督管理局對此有明確指導(dǎo)意見。但是對于小分子單體化合物除了有效性之外，常需要對其作用機制進行研究。因此，中藥小分子單體的藥效學分為有效性研究、機制研究兩部分。對于機制研究，人們常有兩種認識：一種是將相關(guān)指標進行檢測，然后分析、匯總所測指標來表述其作用機制。這種方法實質(zhì)上是一種篩選指標，只能說明受試藥物的作用機制有相關(guān)，卻不等同于機制，國外將其稱之為“表象指標”。國內(nèi)則有人將其稱之為機制，甚至有些人還將其指標只當作“機制”，這種觀點并不嚴謹；另一種是在表達了相關(guān)指標之后，將這些指標的內(nèi)在聯(lián)系進行因果關(guān)系確證，最終確定其邏輯關(guān)系，這才是真正意義上的機制研究。該研究思路需要使用各種生物技術(shù)和方法，通過阻斷、敲除等方法來表明受試藥物作用靶點的特異性、唯一性。

4 藥物作用靶點確認

與合成小分子不同的是，天然小分子單體作用靶點未知，靶點涉及很多方面。在這一點上，天然小分子作用與中藥復(fù)方一致，即靶點不確定和可能存在的多靶點。因此，在新藥研究中對于靶點確認上要有一個特定范圍的篩選。而不是僅僅對研究者想表達的靶點進行探討，如此似乎受試藥作用靶點很單一，很具體。但是如果擴大范圍篩選的話，可以還會有許多靶點。所以，新藥研究中要對所申報的臨床適應(yīng)證或者是相關(guān)藥理作用進行本系統(tǒng)內(nèi)的靶點篩選。例如，調(diào)血脂藥不能僅僅是篩選低密度脂蛋白受體（Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR），同時還要對調(diào)血脂相關(guān)的靶點進行篩選，在此基礎(chǔ)上再進行作用機制相關(guān)靶點的研究和因果關(guān)系確證。對于具有調(diào)血脂作用的中藥小分子進行機制研究，僅僅確定所指向性指標是不夠的，還需要對于一般公認的與脂代謝相關(guān)的因子進行表達觀察，才能清楚說明其指向性指標的專屬性。例如，枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9 （Proprotein convertase subtilisin kexin，PCSK9）是近年來發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)脂作用的重要因子[16-18]，要說明受試藥物的作用靶點是PCSK9，不能只觀察該因子，還需要觀察LPL，LDLR，HMGCoA等沒有明顯作用后，才能說明PCSK9指標的專屬性，而事實上往往是受試藥對所測指標均有作用。又比如，研究一種抗腦出血藥，除了對相關(guān)腦出血動物模型進行藥效學觀察外，其凝血系統(tǒng)是必不可少的觀測指標。

在進行作用靶點研究時，以下5點須考慮：①篩選出相關(guān)靶點。②利用生物技術(shù)進行靶點特異性確認，即因果關(guān)系，可以用化學小分子抑制劑，再用相關(guān)基因缺失或蛋白缺失的方法，主要是定點基因突變或者是定點氨基酸突變；也可以從過表達方面反向證明。③研究層次上，先以細胞、酵母等體外實驗為主。再在整體動物實驗從整體水平確認，常用的是轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠。如果所觀察的靶點較明確，也可以用線蟲進行。④進一步確定藥物作用是在轉(zhuǎn)錄水平，還是翻譯水平；是在基因表達還是蛋白水平。⑤在涉及信號通路上，須探討受試藥物對該通路作用點的確切性。即回答是同時作用于該通路上的各個靶點，還是作用于通路的起始靶點（圖2）。

圖2 藥物作用靶點的確定

我們在研究小檗堿（Berberine，BBR）作用機制方面發(fā)現(xiàn)BBR可以分別作用于基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的TATAbox和mRNA尾端的polyA，這兩個位點分別影響了基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達。為了證明這種作用靶點的特異性，即確定因果關(guān)系，我們選擇了兩個因子HSP70和Rb1。前者轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)含有TATAbox，而后者不含TATAbox。BBR表現(xiàn)出對HSP70轉(zhuǎn)錄抑制，而對Rb1沒有抑制作用，這表明了BBR可能作用于轉(zhuǎn)錄區(qū)的TATAbox。為了證明這種作用的特異性，我們將這兩個因子的轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)進行交換，HSP70轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)換為Rb1的啟動區(qū)序列后，BBR對HSP70的轉(zhuǎn)錄抑制作用消失了；Rb1更換為HSP70的轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)序列后，BBR則表現(xiàn)出了轉(zhuǎn)錄抑制的效應(yīng)。進一步，我們將轉(zhuǎn)錄區(qū)的TATAbox序列“TATAAA”進行定點突變?yōu)椤癎GGCGG”，則BBR對HSP70轉(zhuǎn)錄抑制作用消失。而將Rb1轉(zhuǎn)錄區(qū)的“GGGCGG”序列定點突變?yōu)椤癟ATAAA”，則BBR由原來的無明顯作用轉(zhuǎn)而表現(xiàn)出抑制基因表達的效應(yīng)。由此層層遞進地證明了BBR不僅作用于含TATAbox的轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，而且就是“TATAAA”核酸序列[19-21]。

5 小結(jié)

中藥小分子以其來源于天然，而常常表現(xiàn)為靶點的多樣性。因此，表象藥理是常用的觀察方法。但是這種表象指標只能說明其相關(guān)性，而不能說明其因果關(guān)系。所以，這種方法所獲得的信息以及所得的結(jié)果，尚不能簡單稱其為“機制”。這是目前中藥研究中最常出現(xiàn)的問題。要真正意義闡明其機制，尚需要運用分子生物技術(shù)對其進行因果關(guān)系確證后的結(jié)論才能稱之為“作用機制”。即對于表象藥理方法所獲得的結(jié)果，在下結(jié)論時需要謹慎。

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Natural Small Molecules and Their Phenotype Pharmacology and Mechanisms of Drug-Action

Lei Fan1,2, Xing Dongming1, Yan Xiaojin1, Du Lijun1
(1. Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. School of Pharmacology and Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

This report discussed internal characteristics and its related pharmacological researches in natural small molecules (traditional medicines), by comparing with similarities and differences in their concepts, phenotype pharmacological characteristics, specific targets and action mechanisms between natural small molecules and synthetic compounds. Natural small molecules often represented three specific features: unexpected discovery, internal target diversity and multiple mechanisms of action. Therefore, in the pharmacological study of natural small molecules, related targets screening must be performed to determine the correlations of the targets and mechanisms, and finally to identify their specificity. In this report, a systematic in-depth discussion on natural small molecures was pressed ahead with for better understanding and to grasp the correlations and the specificity of natural small molecular actions, which may promote the new-drug discovery and development from natural small molecules (traditional Chinese medicines).

Natural medicines, small molecule, phenotype pharmacology, new-drug research and development

10.11842/wst.2016.06.011

R96

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 國家自然科學基金委青年基金項目（30801523）：石榴葉總酚成分對腦缺血過程中PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的影響及其腦保護作用研究，負責人：雷帆；國家自然科學基金委面上項目（81374006）：基于小檗堿作為DNA插入子探討其對正常與缺血再灌神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)錄作用差異的機制，負責人：邢東明；國家自然科學基金委面上項目（81073092）：從G0/G1期啟動探討小檗堿及黃連對缺血再灌損傷神經(jīng)元保護作用的位點，負責人：杜力軍。

＊＊ 通訊作者：杜力軍，本刊編委，教授，主要研究方向：藥理學。