從生物學角度認識小分子藥理作用機制＊
——中藥小分子研究的思路

王玉剛，謝偉東，雷 帆，王欣佩，杜力軍，邢東明＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室 北京 100084；2.美國德州大學MD Anderson 癌癥研究中心休斯頓 77030；3.清華大學深圳研究生院生命與健康學部 深圳 518055）

從生物學角度認識小分子藥理作用機制＊
——中藥小分子研究的思路

王玉剛1，2，謝偉東3，雷 帆2，王欣佩2，杜力軍2，邢東明2＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室 北京 100084；2.美國德州大學MD Anderson 癌癥研究中心休斯頓 77030；3.清華大學深圳研究生院生命與健康學部 深圳 518055）

中藥小分子是一類從天然產物中分離得到的具有特定生物活性的小分子化合物。按照現代藥物發現類型的劃分標準，中藥小分子的發現主要依靠藥效篩選。基于化合物的藥學特性，構建和優化高精度、高通量新型藥物篩選系統，需要研究人員不斷將新的生物學技術和理念應用于中藥小分子藥理作用機制的準確認識。本綜述將重點討論小分子藥理機制研究中對藥物作用靶點的認識，為中藥小分子研究思路提供借鑒。同時，本文還介紹了一些利用前沿生物學技術研究小分子藥理的實例，最后討論小分子藥理機制研究對現代藥物發現的意義。

中藥小分子 生物學 藥理機制

在對病理機制的理解和藥物發現過程中，基礎醫學對疾病的研究和認識與分子藥理學發展的聯系日漸緊密。新方法和新技術促進基礎醫學研究的發展，基礎醫學新發現為藥物研發提供了新思路、新方向。同時，藥物發現過程對這些新靶點和新機制進行了驗證或者證偽，并為基礎醫學研究提供了新的命題。對藥物靶點的認識直接決定藥物機理研究的內容和深度。

傳統的藥物靶點是指與藥物與生物體系相互作用并產生藥理活性的具體生物分子。這一概念建立在物理性相互作用基礎上，在實際的大多數小分子藥物的作用機理中，并不能得到很好的理解。小分子藥物在生物體系內的相互作用分子遠不止一種，如小檗堿[1]，喜樹堿[2]等。實驗證明大多數小分子藥物的生物活性會根據生物體系所處的生理狀態而表現出多樣性。因此，根據研究和應用的需要，藥物作用靶點概念定義的對象可以靈活拓展到細胞、組織、器官，甚至整個生物體系。將藥物靶點定義的先決條件設定為：藥物在一個特定的時間點或者特定生理狀態下表現出一個或一系列特定的生物學活性。本文將通過綜述目前應用成熟的小分子藥理機制研究手段，從生物學角度對小分子尤其是中藥小分子藥理作用的研究進行討論。

1 小分子藥理研究方法

目前，藥物的作用靶點及作用機制研究常用的方法如下：

1.1 親和性分析法

生物體系內與藥物相互作用的生物大分子是人們對藥物作用靶點的最直觀的理解，因此小分子藥物和生物大分子之間的親和性分析是找到藥物作用靶點最直接的思路和方法。早期的小分子藥物作用靶點研究主要通過化學修飾的方法把小分子化合物與分子標簽連接，將帶有分子標簽的小分子作為固定相去“抓取”生物樣品中能夠與特定小分子化合物相互作用的蛋白，然后通過蛋白質化學的方法對“抓取”到的蛋白進行定性分析[3]。然而，這種方法有兩個主要弊端：①該方法破壞了細胞結構，忽略了小分子藥物在細胞內可能存在的分布規律，因此容易出現“抓取”的生物大分子在實際過程中無法和藥物“相遇”，例如不能進入細胞的藥物就不能“抓取”到細胞內生物大分子，不能進入線粒體的藥物就不能“抓取”到線粒體內蛋白等；②該方法簡單地將活細胞變成了一個無活性的生物大分子庫，忽略了藥物活性對細胞生理狀態的依賴性，因此容易出現“抓取”的生物大分子和特定的生物學活性不對應，或者是根本無法“抓取”相互作用的生物大分子。

為克服上述問題，目前比較成熟的方法是在分子標簽與小分子連接后，將標記的小分子直接給藥到生物體中，在獲得藥效數據的同時固定生物樣品，通過“抓取”有標簽小分子與靶點結合形成的復合體，來研究藥物的作用靶點。該方法能捕捉小分子與生物體內大分子靶點相互作用的產物，精確找到特定生理狀態下小分子的作用靶點。然而，由于標簽在小分子結構上的占位效應可能干擾其與靶點的相互作用，或引起細胞通透性和代謝屬性發生變化，該方法所適用的小分子藥物靶點和機制研究范圍有一定的局限[4]。

并且，因小分子藥物對生物大分子產生作用的前提是小分子的濃度需足夠引起生物大分子產生后續生化信號[1]，當小分子藥物和生物大分子相遇后，能否達到有效作用濃度以及給藥后何時達到有效作用濃度是藥物作用機制研究的另一重要內容，直接關系到小分子藥物在特定生理條件下的生物活性。

1.2 基因表達譜分析法

基因表達譜的改變是生物體系對藥物反應的重要組成部分，得益于基因表達調控機制研究積累的大量數據和類型眾多的基因表達譜、蛋白表達譜、miRNA表達譜等組學研究，可以通過比較基因表達譜的差異縮小藥物作用靶點的尋找范圍，結合大數據技術分析藥物作用機制，通過實驗方法最終確定藥物的作用靶點和機制。這種方法需要大量的資金投入和強大的數據分析團隊支持，一般比較適用于大型研究團隊在結構類似物篩選中得到的先導化合物的研究。例如Boitano通過比較StemRegenin（SR1）與其無藥理活性結構類似物處理細胞后基因表達譜的差異發現了CYP1B1與AHRR的表達變化，分析發現了調控CYP1B1與AHRR表達的轉錄因子AHR是SR1的作用靶點，確定了SR1的藥理作用機制[5]。

同時，基因表達譜的改變實時地對應著生物體的生理狀態，通過大數據分析同一個小分子藥物在不同基因表達譜背景下所產生不同的生物學活性，有助于在眾多生物大分子中找到與小分子藥物特定活性直接相關的候選分子，進而推進小分子藥物作用靶點和作用機制的確定，例如Germain通過發現FADS2在乳腺癌細胞內表達水平與ML239藥效相關性確定了ML239治療乳腺癌的作用靶點和藥理機制[6]。

1.3 測序分析法

快速經濟的測序手段的升級為抗藥性機制的研究提供了平臺。生物在自然界中通過不斷地基因突變而獲得適應生存環境壓力的生物學特性，這種現象在藥物應用領域中體現得最多的是生物體對藥物抗性的獲得。抗藥性突變的確定是藥物作用靶點和作用機制的研究中非常有效的思路和方法，該藥物作用機制研究方法大多數情況下被應用于抗菌藥的機制研究。如Howe團隊為了找到Ribocil抑制大腸桿菌核黃素生成的機制，通過全基因組測序在Ribocil抗性突變株中找到了ribB基因上的特定突變位點，進而利用結構生物學方法分析Ribocil與ribB基因表達產物的共結晶結構，找到了Ribocil的作用靶點和作用機制[7]。但由于抗性突變獲得的偶然性，這種研究路線的可控性有待提高。

1.4 生物信息學分析法

信息學方法在生物醫藥領域的應用使小分子藥物作用機理研究所產生的大量實驗數據得到了很好的歸納和總結，并按不同的使用目的、研究對象、研究內容等建立了不同的數據庫，由此形成相應的新學科，如網絡藥理學。利用大數據和計算機學習的方法對這些數據庫進行分析，建立相關聯的模型，提出可能的藥物作用機制假設用于進一步的實驗驗證。這種方法可以縮小藥物作用機制研究初始階段的尋找范圍，提高研究效率，對熱點化合物的作用機理研究具有重要意義。如Seashore-Ludlow開發的多維集束分析方法，該方法在481個已知作用機制的小分子化合物分別處理664個腫瘤細胞系的數據庫基礎上，通過計算機比對分析歸納化合物已知的作用機制和細胞系生物學特性，構建分析數據庫；將機制未知的化合物處理多個細胞系之后的實驗數據在該分析數據庫內比對后總結出該化合物的作用機制[8]。該類研究方法是目前網絡藥理學和系統藥理學的核心思路。

2 小分子藥理研究對后續藥物開發的意義

精準的藥理作用研究有利于構建高精確度的藥物篩選體系。目前，藥物篩選的主流方向是具有快速、高通量特點的基于靶點的篩選方法，其中以腫瘤特異性蛋白激酶抑制劑篩選最為成功。然而據統計，美國FDA在1998-2008年間批準的藥物中，有56%的I類新藥是通過藥效篩選獲得的，34%的I類新藥是通過靶點篩選獲得[9]。這說明在實際的藥物研發過程中，許多基于靶點的藥物篩選產生的I類新藥沒有通過美國FDA的審批，而傳統的基于藥效的低通量篩選在藥物研發領域里仍然更勝一籌。其主要原因是，現在選擇藥物篩選靶點沒有建立在準確的病理機制或藥理機制的研究基礎上。從整個藥物研發領域的發展出發，精準的藥理作用靶點研究是目前基于靶點藥物篩選應用領域急需解決的問題，也是是精準藥物篩選體系建立的必然需要。

對通過靶點篩選獲得的藥物，作用機理的精準研究有利于不斷優化篩選方案，獲得更好的特異性藥物。由于生物體內生理條件的多樣性、體內信號通路的復雜性，目前我們得到的病理機制或藥理機制可能只是相關的級連通路，雖然把“刺激”輸入生物體這個黑箱后輸出的數據指標與人們設計的一致，但這并不代表人們一定找到了正確的靶標，如果靶點不精準就可能出現藥物副作用等不可預測、不可控的問題，藥物效價低[10]。精準的病理機制、藥物作用機理研究有利于藥物理化性質與作用靶點在時空分布和作用強度上的不斷優化，最大程度上提高藥物作用的特異性，降低副作用的不可控性，提高特定適應癥治療藥物的研發效率。

對于基于藥效篩選發現的藥物而言，精準的藥理機制研究可以找到準確的病理機制和藥物作用的準確機理，這對確定最優化的靶點十分有利，進而可以促進藥物性質的優化。另一方面，在已知的高效低毒的藥理特性的基礎上，對已有藥物作用機理的藥物進行精確的反向研究，有助于發現新的生物信號通路，以此找到針對特定適應癥的治療方案和藥物篩選方案，促進基礎醫學的新發現和新藥研發。此類研究有助于解釋一些機制不明、療效較好的經驗藥物適應癥，及對應疾病的發病機理，對找到關鍵靶點、實現靶點選擇和藥物篩選方式的優化、找到針對同一適應癥的高效藥物十分有利。

3 小結

中藥小分子藥物在生物體系內的作用機制及作用靶點研究是現代藥理學的重要組成部分。其主要目的是精確解釋藥物的作用機理，以此構建具有高精度、高通量、高效率的藥物篩選系統，以促進藥物的發現。生物技術的高速發展為藥理學研究提供了更多樣的技術手段，極大地促進了藥理學的發展。在新技術的應用過程中，藥物作用靶點的定義決定了藥理機制研究的深度和廣度。本文所介紹的生物技術在藥理研究中的應用實例及藥物作用靶點的相關討論將有助于推動中藥新藥的研究。

1 Wang Y G, Kheir M M, Chai Y S, et al. Comprehensive study in the inhibitory effect of berberine on gene transcription, including TATA box. PLoS One, 2011, 6(8): e23495.

2 Carcia-Carbonero R, Supko J G. Current Perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clin Cancer Res, 2002, 8(3): 641-661.

3 Rix U, Superti-Furga G. Target profiling of small molecules by chemical proteomics. Nat Chem Biol, 2009, 5(9): 616-624.

4 Johnson K, Zhu S, Tremblay MS, et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science, 2012, 313: 1929-1935.

5 Boitano A E, Wang J, Romeo R, et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science, 2010, 329: 1345-1348.

6 Germain A R, Carmody L C, Morgan B, et al. Identification of aselective small molecule inhibitor of breast cancer stem cells. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22:3571-3574.

7 Howe J A, Wang H, Fischmann T O, et al. Selective smallmolecule inhibition of an RNA structural element. Nature, 2015, 526:672-677.

8 Seashore-Ludlow B, Rees M G, Cheah J H, et al. Harnessing connectivity in a large-scale small-molecule sensitivity dataset. Cancer Discov, 2015, 5: 1210-1223.

9 Swinney D C, Anthony J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov, 2011, 10(7):507-519.

10 Vincent F, Loria P, Pregel M, et al. Developing predictive assays: the phenotypic screening “rule of 3”. Sci Transi Med, 2015, 7(293):15.

Understanding of Pharmacological Mechanisms of Small Molecules from a Biological Standpoint—A Research Approach of Small Molecules from Extracts of Chinese Materia Medica

Wang Yugang1,2, Xie Weidong3, Lei Fan2, Wang Xinpei2, Du Lijun2, Xing Dongming2
(1.Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Science, School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084,China; 2.MD Anderson Cancer Center, Brain Tumor Center and Department of Neuro-Oncology, The University of Texas, Houston, 77030, USA; 3. Division of Life Science & Health, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China)

Small molecule drugs identified in traditional Chinese materia medica (TCM) were a class of small molecule compounds discovered in natural products, which were mostly discovered by efficacy-based drug screening process. Aiming to optimize the drug abilities of natural products-derivated small molecules and establish high throughput target-based drug screening system, the most advanced biotechnologies were adopted to decipher the drugs’ mechanism of actions (MOA), through which the targets and optimization strategies could be identified. As the importance of drug target in drug discovery process, the concept of the drug target in biological system was principally discussed in this review for better understanding of the small molecular mechanisms of Chinese materia medica. In addition, the instances of the undergoing MOA studies through advanced biotechnologies were also briefly introduced. Besides, in regard to the development of drug discovery, the significance of MOA studies was also discussed.

Small molecules of Chinese materia medica, biology, pharmacological mechanism

10.11842/wst.2016.06.014

R965

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 科學技術部“重大新藥創制”科技重大專項（2012ZX09103-201-041）：糖脂代謝新藥BLP的研究，負責人：邢東明；國家自然科學基金面上項目（81073092）：從G0/G1期啟動探討小檗堿及黃連對缺血再灌損傷神經元保護作用的位點，負責人：杜力軍；清華大學室驗室開放基金（LF20103581）：神經元細胞周期同步化監測，負責人：杜力軍。

＊＊ 通訊作者：邢東明，博士，副研究員，主要研究方向：藥理學。