中藥有效成分作用靶點研究的策略與實踐＊

趙玉男，謝偉東，邢東明，余 煊，杜力軍＊＊

（1.南京中醫藥大學基礎醫學院病理教研室 南京 210046；2.清華大學深圳研究生院生命與健康學部健康科學與技術重點實驗室 深圳 518055；3.清華大學生命科學院藥物藥理研究室 北京 100084）

中藥有效成分作用靶點研究的策略與實踐＊

趙玉男1，謝偉東2，邢東明3，余 煊3，杜力軍3＊＊

（1.南京中醫藥大學基礎醫學院病理教研室 南京 210046；2.清華大學深圳研究生院生命與健康學部健康科學與技術重點實驗室 深圳 518055；3.清華大學生命科學院藥物藥理研究室 北京 100084）

中藥治療疾病的物質基礎、藥效和機制研究已較充分，然而靶點的研究進展相對緩慢，這和靶點研究本身的被動性和難度有一定關系。本文基于國內外文獻報道，并結合筆者的研究實踐，對此進行了較為系統的探討。本文主要介紹三種技術路徑：“線索”驅動、噬菌體展示以及親和垂釣。并提及兩種方案：酶解法和光交聯法。基于這些技術方案，加強中藥有效成分靶點研究的實踐，將會有助于闡明中藥治療疾病的現代科學基礎，有助于發展現代中藥和創新中藥。

中藥 有效成分 作用靶點 噬菌體展示 親和垂釣

應用現代科學技術方法，結合物質基礎研究，揭示中藥治療疾病的現代科學基礎，是中藥藥理學的主要任務之一[1]。該任務的本質是對傳統中藥臨床療效進行證實或證偽的一個科學過程。因此，中藥藥理學也是一個“假說后立”的研究，尋找證據是關鍵環節[2]。對于實驗研究而言，藥理學的證據包括物質基礎、體內過程、藥效、作用機制以及靶點等。在物質基礎和體內過程明確的情況下，“藥效-機制-靶點”可以看成是一條“證據鏈”，用于證實或證偽，在這條“證據鏈”中，靶點是重中之重。

目前，中藥的物質基礎（有效成分）及體內過程已較清楚，有效成分的藥效和作用機制研究也比較充分，然而靶點的研究相對較少，體內作用靶點明確的有效成分寥寥無幾。因此，對于中藥療效的證實或證偽而言，“證據鏈”是不完整的，缺少靶點這樣的有力證據。為此，中藥有效成分體內作用靶點研究應成為中藥藥理學今后的主要研究方向。然而，靶點的研究并非易事，對于少數幾個靶點清楚的有效成分，其體內作用靶點發現的過程有些“偶然性”。 最具代表性的是大麻素受體的發現，80年代末，Matsuda等人將從大鼠大腦皮質cDNA文庫中分離到的一個cDNA（SKR6）穩定轉染到CHO細胞中后，體外與大麻類物質孵育時發現有反應而偶然發現的。“偶然性”其實意味著靶點發現的被動性和困難性，這可能是當前靶點研究成果相對匱乏的原因。為了提高靶點發現的效率，必須要有一套可主動發現有效成分體內作用靶點的技術路徑。當前，國內外科研人員主要提出了3種解決方案，我們將其歸納為：“線索”驅動（Action-Trial Leading）、噬菌體展示（Phage Display）和親和垂釣（Pull Down）[4]等，并展開了相應的科學實踐。本文將以此為主線，對于中藥小分子藥理作用靶點的策略進行初步論述。

1 “線索”驅動

“線索”驅動是指有效成分經體內過程、藥效和作用機制研究后，研究人員根據研究得到的“線索”，推測出或假設和該有效成分可能有相互作用的蛋白質或核酸，然后采用生物技術做靶點的驗證性研究。例如關于小檗堿的研究就是基于該策略，通過研究首次揭示了小檗堿的2個核酸靶點：保持mRNA穩定的Poly（A）和基因轉錄區的TATA box[5]，其研究路徑如下所述：

1.1 小檗堿可進入細胞核

將小檗堿和PC12細胞共孵育，采用激光共聚焦顯微鏡，觀察60 min內的動態發現：隨著時間的推移，綠色熒光（小檗堿）在細胞核的位置開始出現并逐漸加強，暗示小檗堿可進入細胞核。細胞核內小檗堿的高效液相色譜定量分析進一步驗證了上述的發現，時量曲線顯示：小檗堿可快速進入細胞核，達峰時間約為12 h左右[6]。

1.2 小檗堿可與遺傳組分相互作用

進入細胞核的小檗堿可與遺傳組分發生相互作用，早先的研究顯示：作為一種DNA的嵌入劑，小檗堿可與人工合成的DNA發生相互作用。課題組進一步采用熒光能量共振轉移技術，驗證了小檗堿可與天然的遺傳組分相互作用，比如：染色質、質粒和基因組；并采用了等溫滴定量熱法測得小檗堿與染色質、質粒以及基因組的平衡解離常數（K）分別為：15 672、97 380和117 147[6]。

1.3 保持mRNA穩定的Poly（A）

小檗堿雖可與遺傳組分相互作用，但具體作用位點不清楚。課題組在一項小檗堿抗腦缺血再灌注的藥效學研究中發現：小檗堿體外可拮抗氧糖剝奪誘導的PC12細胞凋亡，機制與其阻止模型細胞內Retinoblastoma（Rb）蛋白表達的下降有關；此外，對于Rb蛋白敲除的PC12細胞系，小檗堿喪失了其抗細胞凋亡的作用；這兩個實驗結果提示，Rb蛋白是小檗堿抗氧糖剝奪藥效的作用環節。

進一步研究發現，小檗堿拮抗模型細胞Rb蛋白表達下降的機制和Rb的mRNA有關。然而，小檗堿并不能增強Rb的轉錄活性，說明小檗堿不能增加Rb的mRNA表達水平。因此，課題組推測小檗堿抗模型細胞內Rb mRNA下降的機制可能與其能保持Rb mRNA的穩定有關。上述推測得到了體外實驗的證實，研究發現：在采用放線菌素D抑制基因轉錄的模式細胞中，氧糖剝奪可明顯增加Rb mRNA降解的速度；小檗堿不但能減弱模式細胞在正常培養狀態下Rb mRNA降解的速度，還能拮抗氧糖剝奪導致的Rb mRNA降解速度的增加。

眾所周知，mRNA的Poly（A）尾巴與其穩定性密切相關，那么小檗堿穩定Rb mRNA的機制是否與Poly（A）有關。課題組分別構建了帶Poly（A）和不帶Poly（ A）的Rb表達質粒，帶Pol（A）的Rb表達質粒轉染細胞后，其胞內Rb mRNA的水平遠高于不帶Poly（ A）的Rb表達質粒。而且，小檗堿只對帶Poly（A）的Rb mRNA有作用；對不帶Poly（A）的Rb mRNA，無論是在正常培養狀態下還是氧糖剝奪狀態下，小檗堿均不能發揮其抑制mRNA降解的作用。

從抗凋亡、Rb蛋白、Rb mRNA、mRNA的穩定到Poly（A），根據實驗結果推測Poly（A）是小檗堿的核酸作用靶點。最后，課題組采用熒光光譜（FRET）及其二維核磁共振譜（2D-NMR）技術確證小檗堿和Poly（A）之間存在直接的物理相互作用，Poly（A）是小檗堿的核酸作用靶點[5,7]。

1.4 基因轉錄區的TATA box

課題組在另一項小檗堿抗熱應激的藥效學研究中發現：小檗堿可拮抗熱應激引起的小鼠體溫升高，抑制模型動物過多分泌熱休克蛋白70（HSP70）；而且，HSP70的蛋白水平與其mRNA水平呈正相關性，提示小檗堿抑制HSP70的蛋白表達與HSP70的mRNA密切相關[8]。

進一步研究發現，小檗堿可通過直接抑制HSP70的轉錄活性，降低HSP70的mRNA表達，進而導致HSP70蛋白水平的下降。值得注意是，小檗堿對Rb的轉錄活性并沒有影響。這兩個試驗結果提示，小檗堿抑制HSP70的轉錄活性可能與轉錄系統中的酶活性無關，而與基因啟動子區的堿基序列有關，否則不會出現這種選擇性轉錄活性降低的現象。分析HSP70和Rb基因啟動子區的堿基序列發現，HSP70基因啟動子區含TATA box，而Rb基因啟動子區含GC box，不含TATA box，那么小檗堿抑制HSP70的轉錄活性是否與TATA box有關。課題組分別構建了啟動子區含TATA box和GC box的HSP70表達質粒，轉染細胞后小檗堿只對啟動子區含TATA box的HSP70質粒表達有抑制作用，而對啟動子區含GC box的HSP70質粒表達無明顯影響，表明小檗堿抑制HSP70的轉錄活性與TATA box相關[5]。

至此，從抗熱應激、HSP70蛋白、HSP70 mRNA、mRNA的轉錄到TATA box，課題組同樣在眾多“線索”的指引下，高度懷疑TATA box是小檗堿的核酸作用靶點。與Poly（A）一樣，課題組最后采用FRET技術確證小檗堿和TATA box之間存在直接的物理相互作用，TATA box是小檗堿另外一個核酸作用靶點；并基于電泳遷移率變動分析（EMSA）和免疫共沉淀技術（ChIP），發現小檗堿和TATA box結合后，可干預TATA box和TATA結合蛋白（TBP）之間的結合，進而干擾基因轉錄[6]。

2 噬菌體展示

噬菌體展示技術最早建立于1985年，其原理是以噬菌體為載體，將外源基因片段克隆至噬菌體外殼蛋白基因中，并以融合蛋白的形式表達于噬菌體外殼。噬菌體本身的粘附、侵入及整合功能并不會因外源性DNA片段的插入而受到影響，同時外源片段在噬菌體外殼的表達也保持了其原有的三維空間構像。大量的這樣表達有外源片段的噬菌體就組成了噬菌體展示文庫。噬菌體展示文庫提供了大量的蛋白質/多肽結構信息，實現了高通量和高效率篩選的可能性，已廣泛運用于抗原表位分析、分子相互作用、單克隆抗體的制備、疫苗研制及藥物篩選等多個研究領域[9]。近些年來，陸續有研究人員提出將噬菌體展示技術運用到小分子藥物體內靶點蛋白的發現上[10-12]。

2.1 生物淘洗

噬菌體展示技術的篩選原理又稱“生物淘洗”，該技術是利用分子間的特異性親和力進行的。首先，將待研究的目標分子（小分子或大分子）通過共價鍵固定在載體上，加入噬菌體文庫，令其充分相互作用進行結合選擇；在此過程中，可與目標分子特異性結合的噬菌體克隆將結合到載體上，未結合的噬菌體克隆被直接洗去。然后，用緩沖液將結合的噬菌體克隆洗脫下來，收集洗脫的噬菌體克隆感染宿主進行擴增，獲得的噬菌體再次重復上述的結合篩選。如此經過“吸附-洗脫-擴增”循環式的3-5輪篩選，最終洗脫得到的噬菌體克隆經初步結合實驗鑒定后，分別挑取單個克隆進行基因序列分析，根據測序結果分析得到其對應的基本氨基酸序列，即為可與目標分子有特異性結合的氨基酸序列。最后，在生物信息學的幫助下，分析生物體內含有上述氨基酸序列的蛋白質，這些蛋白質即有可能是目標分子在生物體內的靶蛋白。

1999年，Rodi等[13]較早利用上述噬菌體展示技術，對抗癌藥物紫杉醇進行生物淘選，最終鑒定Bcl-2可能是紫杉醇在體內的作用靶點。Yu等[14]將地塞米松固定在Eppendorf管壁上，4輪淘洗后鑒定得到了與其結合的氨基酸序列，經GenBank檢索發現具有該氨基酸序列的蛋白質為細胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ和白蛋白，從而發現了糖皮質激素體內其它可能存在的作用位點。Van Dorst等[15]采用T7 cDNA噬菌體展示文庫淘選，經BLAST同源檢索后，既得到了雙酚A已知的作用靶點α-微管蛋白，同時也發現了雙酚A未知新的疑似作用靶蛋白-轉錄相關酸性卷曲蛋白3（Transforming Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3，TACC3）。2011年，Van Dorst等[16]采用了相同的技術研究了17β雌二醇體內的蛋白靶點，發現了兩個可能的未知靶點：beclin 1和ATP合成酶F0亞單位6。類似的研究還包括對全氟辛烷磺酸[17]、環孢霉素A[18]、甲氨蝶呤[19]、伊立替康[20]和撲熱息痛[21]等單體小分子藥物，以及三水白虎湯[22]等多組分有效成分的研究上。

作為最早用來主動發現小分子體內作用靶點的方案，噬菌體展示中的生物淘洗法已有多個成功的實例報道。然而，從對糖皮質激素和雌激素的研究結果來看，該方案并未發現大家所熟知的糖皮質激素受體或雌激素受體，因此有一定的局限性，這可能和噬菌體展示文庫的容量大小有關。噬菌體展示方案在2010年左右迎來一個研究高峰；不過自2013年起至今，在Pubmed上檢索“phage display”已鮮有最新研究報道。此外，通過噬菌體展示方案得到的疑似靶蛋白，更多都停留在疑似階段，很少有進一步的小分子與靶點之間的結構和功能確證性研究。此為其局限之處。

2.2 功能基團熒光展示

上述生物淘洗法通過小分子化合物上的功能基團與固相載體偶聯，也會導致功能基團周邊的空間結構受到阻礙，因此就不會“垂釣”出與該空間結構有親和力的噬菌體克隆，功能基團熒光展示法可使小分子化合物在自由狀態下與噬菌體文庫進行結合，理論上可彌補該不足。盡管該方法目前還未出現成功的案例報道，但它已經開始在一些實驗室進行實踐，原理如下：

首先，如果小分子化合物與噬菌體克隆發生特異性結合，那么該小分子化合物有可能會屏蔽掉多肽上結合處的某些功能基團，比如氨基、羧基或者酚羥基等。然后，用化學反應的方法將那些沒有被屏蔽的功能基團保護起來。接著，將小分子化合物從結合的噬菌體克隆上洗脫下來，暴露出那些活性功能基團，再用化學反應的方法將這些功能基團連接上熒光物質。最后，將這些有熒光的噬菌體克隆挑選出來感染宿主進行擴增，獲得的噬菌體再次重復上述的流程。如此經過3-5輪循環式篩選，最終可得到與小分子化合物特異性結合的噬菌體克隆，剩下的步驟同上述生物淘洗法。

圖1 R1位點含糖基的人參皂苷單體和含氨基的樹脂偶聯后示意圖

3 親和垂釣

在生物分子中，有些分子的特定結構部位能夠同其他分子相互識別并結合，如酶與底物的識別結合、受體與配體的識別結合、抗體與抗原的識別結合，這種結合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結合解除。生物分子間的這種結合能力稱為親和力。親和垂釣就是根據這個原理，將目標分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質直接流出，從而與目標蛋白質分開，然后選用適當的洗脫液，改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。

中藥有效成分為小分子化合物，可作為“配體”或者“底物”直接連接（連接原理可參照小分子半抗原/人工抗原的制備[23]）或通過引入標簽間接連接到固相載體上（比如：小分子引入生物素標簽，再和有親和素的固相載體連接），然后通過親和層析的方法“垂釣”出與其有親和作用的蛋白質群（在“垂釣”出靶蛋白的同時也會帶出與靶蛋白有親和力的其它蛋白質），再通過1維（1D）或者2維（2D）蛋白質凝膠電泳進行分離，挖取單個蛋白質斑點進行質譜鑒定。最后，根據鑒定的結果，采用分子間相互作用研究技術對鑒定出的蛋白質和目標小分子進一步做親和力分析，從而發現可與目標小分子直接發生相互作用的蛋白質靶點。自蛋白質質譜鑒定商業化運作后，斷續出現采用該技術探索小分子體內蛋白質作用靶點的報道。2007年，Wulff等[24]采用生物素標簽將（+）-avrainvillamide連接到固相載體上“垂釣”細胞裂解液中的蛋白質，基于蛋白質質譜分析、Werstern Blot、競爭性親和抑制以及基因突變等技術，鑒定出（+）-avrainvillamide細胞內的一個作用靶點為核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）。2015年，Wang等[25]同樣采用生物素標簽將青蒿素連接到固相載體上，從瘧原蟲中“垂釣”出多達124個疑似蛋白質作用靶點，并經熒光標簽技術確認血紅素可能是青蒿素對寄生蟲產生殺傷作用的關鍵環節。

本課題組采用小分子化合物和載體直接連接的方法，探索了人參皂苷抗疲勞藥效的體內蛋白質作用靶點[26,27]。分子間偶聯通常會導致小分子偶聯處的空間結構受到阻礙，因此難以“垂釣”出與該空間結構有親和力的蛋白質。由圖1可知，如果通過R1位點的糖基采用高碘酸氧化的方法和固相載體偶聯，那么R1位點周邊的空間結構將會被屏蔽。同理，如果通過R3位點的糖基和固相載體偶聯，那么R3位點周邊的空間結構將會被屏蔽，但是R1位點周邊的空間結構會充分暴露。故我們推測，可以采用混合皂苷作為“配體”或者“底物”有效解決空間結構屏蔽，以實現人參皂苷的空間結構充分暴露。為此，我們采用高純度的人參總皂苷作為偶聯對象，通過親和樹脂的制備、骨骼肌勻漿液親和“垂釣”、蛋白質電泳分析以及蛋白質質譜鑒定，發現8個疑似蛋白（表1）。

表1 蛋白質質譜鑒定各凝膠條帶所得疑似蛋白質

由于在人參總皂苷親和“垂釣”腦組織勻漿實驗中也鑒定出了肌酸激酶，本課題組選定肌酸激酶，采用生物膜干涉技術優先對其進行確認。采用ForteBio的分子間相互作用儀Octet RED96研究了人參皂苷單體、苷元與肌酸激酶（MM型和MB型）的相互作用，獲得其結合常數、解離常數和親和力等動力學參數。結果顯示：僅原人參二醇和肌酸激酶有一定的分子間相互作用，進一步結合解離動力學研究得出：原人參二醇與肌酸激酶（MM型）的親和力（KD）值為2.53×10-5,與肌酸激酶（MB型）的親和力（KD）值為9.23×10-6。上述結果提示我們，盡管肌酸激酶是人參總皂苷偶聯樹脂親和“垂釣”而得，但實際上和肌酸激酶有較強相互作用的是原人參二醇。

原人參二醇與肌酸激酶相互作用之后，會對肌酸激酶產生何種效應，我們初步分析了原人參二醇體外對肌酸激酶活性的影響，發現原人參二醇與肌酸激酶相互作用后可增加該酶的活性，可能是肌酸激酶的激活劑。由于肌酸激酶是一個與細胞內能量轉運、肌肉收縮以及ATP再生有直接關系的重要激酶，因此肌酸激酶活性的增加將有助于機體抗物理疲勞，再加上人參總皂苷中的二醇型皂苷可在體內代謝成原人參二醇，從而可合理解釋人參總皂苷為什么可以抗疲勞。不過，該解釋需要體內外實驗的證實，目前該部分的研究正在進行中。

總之，親和“垂釣”方案與蛋白質質譜鑒定技術的成熟密不可分，雖已有一些成功的案例報道，但整體也還處于技術路線優化探索的階段。

4 小結

綜上所述，除了偶然發現之外，我們也可以依靠“線索”或者篩選的方法來主動探索中藥有效成分體內的作用靶點。“線索”驅動方案相對耗時、耗力，并需要確保每個“線索”的真實性和可靠性，在邏輯思維的指引下向作用靶點逐漸靠近。從原理上來看，噬菌體展示和親和垂釣是帶有篩選性質的兩套完全不同的技術方案；從發現高度疑似靶蛋白的角度上來看，這兩個方案相對快速和高效。

除此，目前還有幾種處于探索階段的技術方案，比如：酶解法[28,29]和光交聯法[30]。所有這些技術方案最初應用的出發點可能并不是為了小分子作用靶點的發現，但經適當調整后用于中藥有效成分作用靶點的探索均是可行的。因此，基于這些技術方案，加強實踐，一定能揭示中藥有效成分體內的作用靶點，如此將有助于闡明中藥作用機制，及其相關藥物的研究與開發。

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Advances in Research Approachs of Action Targets of Active Ingredients from Chinese Herbs

Zhao Yunan1, Xie Weidong2, Xing Dongming3, Yu Xuan3, Du Lijun3
(1. Laboratory of Pathological Sciences, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2. Key Laboratory of Health Science and Technology, Division of Life Science & Health, Graduate School at

Nowadays, there has been many researches on the material basis, effectiveness and action mechanisms of Chinese herbs. However, the action target research of active ingredients from herbs is relatively less, which may be associated with its own passivity and difficulty of current target research. For improving the target discovery efficiency of active components, it is critical to approach some initiatives by technical routes to find targets. In this review, based on the domestic and foreign literatures and our previous researches, three different technical routes for the target discovery of active ingredients were introduced in detail, including “clue” drive, phage display and pull-down, and other two options--drug affinity responsive target stability (DARTS) and light cross-linking. Using these technical approaches, it is benefitial to clarifing the modern science basis of Chinese herbs by strengthening the target research practice of active components, and developing modern and innovative Chinese herbs.

Chinese herbs, active ingredients, action target, phage display, pull down

10.11842/wst.2016.06.012

R96

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-13

＊ 國家自然科學基金委青年基金項目（81303246）：腦局部糖原代謝在人參總皂苷抗應激致海馬結構可塑性損傷中的作用研究，負責人：趙玉男；國家自然科學基金委重大研究計劃（90713043）：基于小檗堿神經元保護作用探討其PI3-K/AKT作用的始動位點及其信號轉導，負責人：杜力軍。＊＊ 通訊作者：杜力軍，本刊編委，教授，主要研究方向：藥理學。