小分子藥物跨膜轉運與作用靶點＊
——對中藥小分子藥理研究的思考

趙 爽，姜敬非，王雪莉，謝偉東，余 煊，杜力軍＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室 北京 100084；2.加拿大阿爾伯塔大學化學系 埃德蒙頓T6G2G2；3.清華大學深圳研究生院生命與健康學部 深圳 518055）

小分子藥物跨膜轉運與作用靶點＊
——對中藥小分子藥理研究的思考

趙 爽1，2，姜敬非1，王雪莉1，謝偉東3，余 煊1，杜力軍1＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室 北京 100084；2.加拿大阿爾伯塔大學化學系 埃德蒙頓T6G2G2；3.清華大學深圳研究生院生命與健康學部 深圳 518055）

本文以中藥小分子為例對小分子藥物的跨膜轉運研究進展及方法進行了綜述，并結合作者研究成果，對小分子藥物跨膜轉運與作用靶點進行了分析和探討。目前，研究小分子轉運的檢測方法有HPLC、 LC/MS，還可以借助其熒光成像利用共聚焦技術進行觀測。在研究過程中，確定小分子的轉運方式的同時，也要探討其外排方式，并要確定其有無代謝及其可能的代謝產物。對小分子藥物的細胞跨膜轉運研究將有助于確定小分子作用的靶點，有助于對其藥理作用的探討和闡釋。

小分子藥物 跨膜轉運 神經細胞 天然小分子

對小分子在細胞水平的跨膜轉運研究，最早開始于對神經遞質在突觸傳遞過程中的性質研究[1]。多種內源性小分子的跨膜轉運和代謝過程已被報道[2，3]。外源性藥物分子在細胞水平的運輸、代謝行為是發揮藥效的基礎[4]。因此，藥物的跨膜轉運及代謝過程研究，對確定藥物作用靶點，闡明藥理活性的分子機制以及理解其藥效物質基礎十分重要[5，6]。本文結合作者的研究成果，對小分子尤其是天然小分子的跨膜轉運進行了綜述和分析，旨在對這一命題進行交流，以促進天然小分子的新藥研發。

1 小分子跨膜轉運入胞特點

幾種小分子跨膜轉運的機制模型已被研究證實，包括不借助載體的簡單擴散、載體介導的易化擴散、主動運輸等[7]。其中，易化擴散與主動運輸需要轉運蛋白的協助，表現出底物特異性的特點；主動運輸依靠ATP或者離子勢能提供能量，可以逆濃度梯度跨細胞膜運輸物質。藥物分子根據其大小、化學結構、在胞外環境中電荷性質等因素會有不同的跨膜運輸入胞的行為（Uptake into Cells）。一般而言，非離子型、親脂性的藥物分子更容易通過細胞膜的脂雙層進入胞內；而親水性的藥物則較難通過簡單擴散進入細胞，它們的跨膜轉運需要借助載體的輔助，一些體積較大的分子則有可能通過胞吞的方式進入細胞[8]。因此，小分子藥物電荷、極性/非極性功能團的改變，能顯著影響其跨膜運輸的方式，進而影響其作用靶點[9，10]。例如，麻黃堿與甲基苯丙胺是腎上腺素的結構類似物，其去除了腎上腺素苯環上的極性羥基基團 （圖1）。因此，與腎上腺素相比，它們更容易穿過細胞膜進入細胞，這促進了它們在腸道的吸收與在大腦的分布[11]。同時，結構上的改變也影響它們在細胞水平的作用方式。盡管麻黃堿與腎上腺素一樣，可以與甲基苯丙胺都能夠直接刺激神經突觸，作用于細胞表面的腎上腺素受體，但它們的主要作用于胞內靶點，促進去甲腎上腺素的釋放[12，13]。因此，藥物分子在細胞水平跨膜轉運的研究對理解其作用靶點與作用方式有重要意義。

圖1 腎上腺素（A）、麻黃堿（B）與甲基苯丙胺（C）的結構式

2 研究跨膜轉運與作用靶點的新方法

2.1 高效液相色譜-質譜聯用

研究細胞內外藥物分子含量變化及代謝產物，闡述藥物分子跨細胞膜轉運的可能性與方式（簡單擴散、易化擴散、主動運輸等）常用高效液相色譜-質譜聯用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）。該方法主要通過液相色譜定量分析細胞內外藥物分子的含量與給藥劑量、能量需求以及時間等的關系，來判斷其轉運方式[14]。而質譜作為檢測器，具有高靈敏度、低檢測限、可進行結構分析的特點。HPLC-MS技術可以準確測定胞內外低濃度的藥物分子。此外，進入胞內的原型藥物分子可能會在胞內代謝酶的作用下發生結構轉變，而結合靶點、發揮其藥效功能的也可能是其結構類似物。因此，利用HPLC-MS技術探索其所有可能結構類似物，能夠幫助我們了解其發揮藥效的物質基礎[15，16]。

2.2 熒光成像定量

熒光成像定量法主要研究細胞內外藥物分子含量變化及區域分布。一些含有共軛結構或剛性平面結構的藥物分子具有熒光性質，利用激光掃描共聚焦顯微鏡等高分辨率、高靈敏度的顯微成像手段，可以直接觀察該類藥物跨膜轉運進入細胞的過程，甚至可以進一步描述其在胞內分布的情況，例如觀察其是否可進入細胞核發揮藥效功能，以此判斷其作用靶點是否位于細胞核內[17]。同時，基于熒光強度的定量分析也可以描述其跨膜轉運、胞內分布的動力學特點[14]。

2.3 譜學分析技術

譜學分析技術主要利用小分子化合物與細胞膜不同區域結合后相關譜信號（如核磁共振波譜NMR、電子自旋共振譜ESR等）產生的變化研究轉運過程的細節。例如，由于藥物分子在不同化學環境中NMR譜特征峰會發生遷移，根據譜圖可以判斷在跨膜轉運過程中與藥物分子結合的細胞膜化學成分（例如膜脂質組成），進而推斷其轉運方式與相關機制[18]。此外，通過對細胞膜不同區域進行自旋標記，利用ESR譜也可以判斷藥物分子與細胞膜相互作用的具體機制[19]。

2.4 轉運蛋白研究技術

轉運蛋白研究技術可以明確參與轉運過程的其他成分，尤其是轉運蛋白的信息。目前，最主要的兩類轉運蛋白是ABC轉運蛋白超家族（ ATP-Binding Cassette Superfamily）[20]和SLC轉運蛋白超家族（Solute Carrier Superfamily）[21]。ABC轉運蛋白（從ATP水解過程獲得能量，一般發揮著藥物外排的功能，例如P-糖蛋白（P-glycoprotein）；而SLC轉運蛋白（如有機陰離子轉運體）則主要參與吸收小分子進入細胞的過程。了解藥物分子進入細胞與外排的過程，能從時間、空間等多種角度理解其在細胞水平的作用機制，同時對研究藥物間相互作用也有指導意義。這方面的實驗思路包括在藥物作用情況下的蛋白定量[22]，通過蛋白表達調控觀察藥物轉運的變化、采用特定轉運體抑制劑等[23]。

另外，除了直接實驗研究轉運蛋白與藥物分子的相互作用，利用計算機模擬，也可以通過化學結構角度判斷藥物-蛋白結合的可能性，推斷其轉運機制。計算機輔助分子對接技術就是基于轉運蛋白與分子結構，虛擬研究其可能的轉運方式。鑒于其低成本、迅速方便的特點，在初期篩選可能轉運蛋白的過程中發揮重要作用[24]。

3 研究跨膜轉運與作用靶點的新思路

眾所周知，轉運蛋白對手性藥物具有立體選擇性。現階段的研究要求藥物小分子化學結構與跨膜轉運機制的關系被更全面、更細致的理解[25]。其中很重要的發現是轉運蛋白對藥物的手性異構體具有立體選擇性的作用，而同時藥物分子的手性結構也與其作用機理、靶點相關聯[26]。

“單轉運體”（Carrier-Mediated Transport）理論對“共同存在”（Transmembrane-Diffusion Transport）理論轉運的沖擊。在定量研究的基礎上，藥物跨膜轉運的基本觀點也得到了客觀的討論[8]。傳統觀點中，載體介導的轉運與被動擴散共同構成了分子跨膜轉運的主要機制。近年來，有研究報道認為，相比較載體介導的轉運，跨細胞膜脂雙層的被動擴散在分子轉運過程中沒有顯著的重要性。這兩種觀點（即 “共同存在”理論與“單轉運體”理論）引發了多方面的討論與研究[27，28]。盡管目前沒有形成統一的定論，但這樣的思辨與討論將顯著促進藥物跨膜轉運與作用靶點的研究。

在調控藥物跨膜轉運過程方面，除對藥物跨膜轉運機制理解研究外，越來越多的研究開始關注如何促進藥物跨膜轉運的過程，以此提高藥物的生物利用度。其中，細胞穿透肽引起廣泛關注，這種短肽鏈可以幫助攜帶多種結構的分子進入細胞，包括小分子化合物，大分子蛋白、病毒顆粒等[29]。如何利用該技術，在不影響藥物作用靶點的情況下促進其跨膜轉運，成為研究熱點[30，31]。

4 天然小分子跨膜轉運的研究

我們曾經對小檗堿（Berberine）這一具有多種藥理活性的天然小分子進行了研究。小檗堿作為一個經典的抗腸道感染藥物，能夠作用于中樞神經，具有調節腦功能的作用。除了藥理研究之外，對其在腦內的分布及其神經元跨膜轉運的研究，則是從物質上提供了小檗堿能否作用于中樞神經系統的直接證據。首先，我們在腦內組織分布和腦脊液等相關實驗中，在腦內檢測出小檗堿，證明其可以在腦內分布。隨后，我們對其在神經細胞跨膜轉運方面進行了研究，表明小檗堿可以跨細胞轉運，其轉運方式為主動轉運，且有易化擴散的特點，其向胞內轉運需要陽離子轉運體介入。進入到細胞內小檗堿則由分布于細胞膜上的逆轉運蛋白p-糖蛋白（p-glycoprotein，p-GP）轉運出細胞。由此表明，小檗堿可以進入細胞內，直接作用于胞內或核內相關靶點而起到相應的藥理作用，為小檗堿可以作用于中樞神經系統提供了實驗證據[32，33]。

此外，針對小檗堿抗腫瘤作用，且不同組織源瘤細胞對小檗堿耐受量差異明顯的現象，我們從跨膜轉運角度、選擇了3種報道最多的瘤細胞（人源肝癌HepG2，人源宮頸癌HeLa, 人源小膠質SY5Y）進行小檗堿跨膜轉運的研究。結果表明，小檗堿均可跨膜轉入這3種細胞，并經細胞膜上的逆轉運蛋白p-GP轉出。但是，其中的HeLa和SY5Y細胞中小檗堿胞內濃度在達峰后很快下降，而HepG2細胞中小檗堿濃度持續維持在高濃度水平。由此說明，不同瘤組織源細胞對小檗堿耐藥量的差異與維持細胞內有效濃度有關。進一步觀察發現，HeLa和SY5Y細胞中p-GP表達上調，而HepG2細胞的p-GP表達則下調，由此也就解釋了HepG2細胞內小檗堿濃度維持在較高水平與其逆轉運蛋白表達受到抑制有關。對這3種細胞構建啟動子的質粒的實驗結果表明，小檗堿對這3種細胞的基因轉錄表達均無明顯作用。這提示不同瘤源細胞胞內的復雜性[34]。

巴西蘇木紅素（Brazilein）具有防治腦缺血損傷的作用，我們對其進行了神經細胞的跨膜轉運實驗。觀察結果表明，巴西蘇木紅素以被動擴散的方式進入細胞，也經逆轉運蛋白p-PG轉出。同時，巴西蘇木紅素在神經細胞內經兒茶酚氧位甲基轉移酶（Catechins Oxygen Methyl Transferase，COMT）催化，生成新的代謝產物10-O-甲基巴西蘇木紅素。該研究首次發現并報道了神經元內COMT催化天然小分子的現象[14]。

對黃芩苷（Baicalin）的神經元跨膜轉運研究表明，黃芩苷跨膜進入神經細胞呈濃度依賴性，且受到鈣離子拮抗劑和p-GP抑制劑的影響。進入細胞內的黃芩苷可以產生代謝產物6-甲氧基-黃芩苷，這一代謝產物在給藥小鼠的外周血內也可以檢測到。由此也更正了以往認為的6-甲氧基-黃芩苷為體內（肝）代謝產物的認識。而且，這一代謝產物很可能來自于中樞神經系統[35]。

5 小結

由于小分子藥物作用的最終靶位在細胞，包括細胞膜受體、細胞內的亞細胞器或細胞因子、細胞核等。因此，小分子細胞跨膜轉運研究，將有助于快速找到小分子的作用靶點，對及時區分和確定其作用靶點位置具有一定的參考價值。同時，小分子的跨膜轉運方式、排除機制及胞內代謝產物的檢測與分析等，都有助于發現和解釋小分子復雜的藥理作用機制。

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Cell Membrane Transport and Targets of Small Molecules--Thinking over Pharmacological Researches on Small Molecules from Extracts of Chinese Materia Medica

Zhao Shuang1,2, Jiang Jingfei1, Wang Xueli1, Xie Weidong3, Yu Xuan1, Du Lijun1
(1. Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Science, School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. Department of Chemistry, University of Alberta, Edmonton T6G2G2, Canada; 3. Division of Life Science & Health, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China)

In this paper, a research progress on the transmembrane transport of small-molecular drugs, especially natural small-molecular drugs, was summarized. Combined with previous studies in our group, the details in transmembrane transport of small molecules were explained and discussed. Detection methods of transport of small molecules involved HPLC and LC / MS, and fluorescence imaging via confocal observation techniques. During the studies, transportations of small molecules needed to be determined, while efflux means also should be explored to confirm whether accompanying with metabolism and related metabolites. In conclusion, the studies of cell membrane transport of small-molecular drugs may help determine the targets of small molecules and elucidate their pharmacological actions.

Small molecules, transmembrane transport, neurons, natural small molecule

10.11842/wst.2016.06.015

R965.1

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-05-24

修回日期：2016-06-14

＊ 科學技術部“重大新藥創制”科技重大專項（2012ZX09102-201-008）：國家一類中藥新藥巴西蘇木紅素注射劑的研究，負責人：杜力軍；清華大學創新基金（LF20103579）：小分子藥物跨膜轉運的研究，負責人：杜力軍。

＊＊ 通訊作者：杜力軍，本刊編委，教授，主要研究方向：藥理學。