5種江西特色盆景植物根際微生物群落特征比較研究

毛坤財，鄒貴武，鄧光華，劉　瑋

(1.江西農業大學 園林與藝術學院，南昌，330045；2.江西省林業干部培訓中心，南昌，330045)

?

5種江西特色盆景植物根際微生物群落特征比較研究

毛坤財1，2，鄒貴武1，鄧光華1，劉瑋*

(1.江西農業大學 園林與藝術學院，南昌，330045；2.江西省林業干部培訓中心，南昌，330045)

摘要：應用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)方法對三葉赤楠、火棘、三角楓、雞爪槭和金邊瑞香這5種江西特色盆景樹種根際微生物特征進行了比較研究。結果表明：PCR-DGGE對于盆景樹種根際微生物特征響應良好，DGGE圖譜可以明顯反映出5種盆景樹種根際微生物的差異。不同樹種根際微生物特征有很大區別，雞爪槭、三角楓根際微生物多樣性指數最高，為3.121和2.876，并且根際微生物群落相似程度很高；而火棘根際微生物多樣性指數最低，為1.038。這種根際微生物群落的差異可能是由不同盆景植物的根系分泌物差異所造成的，雞爪槭、三角楓根際微生物群落相似可能是由于其系統發育地位較近(槭樹科槭屬)所造成的。而火棘(薔薇科)根際微生物多樣性較低可能是由于薔薇科植物根系分泌物富含三萜酸類物質，對微生物具有抑制作用的原因。

關鍵詞：盆景樹種；根際微生物多樣性；PCR-DGGE分析

引文格式：毛坤財，鄒貴武，鄧光華，等.5種江西特色盆景植物根際微生物群落特征比較研究[J].森林工程，2016，32(1)：33-36.

0引言

盆景是以植物、山石等材料，經過藝術創作和園藝栽培，將自然界的優美景色集中、典型地在盆中進行塑造，是我國優秀的傳統藝術之一[1]。目前對于盆景植物的研究多集中于栽培、造型和風格鑒賞等領域[2-3]，而關于盆景植物根際微生物生態學的研究只有少數報道[4]。由于根際微生物在地上植物生長、養分吸收及抗性形成方面起著重要的反饋調控作用，因此研究盆景植物根際微生物的群落特征及變化趨勢對于提高盆景養護水平，促進這一古老藝術形式的繼承發展有著現實的意義。傳統根際微生物學研究主要采用平板涂布、氯仿熏蒸等方法來測定土壤微生物生物量、基礎呼吸和可培養微生物區系等[5-6]，而這些方法只能提供部分根際微生物功能、群落等信息，具有一定的局限性。近年來分子生物學技術的廣泛發展、應用，為根際微生物的研究提供了更為便利和清晰的方法手段。聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術是基于核糖體DNA的保守序列設計出不同微生物類群的特異性引物，并通過相關的分子生物學測定技術研究其群落特征[7-8]。本研究采用PCR-DGGE方法，對五種江西常見盆景植物：三葉赤楠(Syzygiumgrijsii，桃金娘科蒲桃屬，后文簡寫為Sg)、火棘(Pyracanthafortuneana，薔薇科火棘屬，Pf)、三角楓(Acerbuergerianum，槭樹科槭屬，Ab)、雞爪槭(Acerpalmatum，槭樹科槭屬，Ap)、金邊瑞香(Daphneodora，瑞香科Thymelaeaceae瑞香屬DaphneLinn.植物，Do)的根際微生物特征進行研究，這5種植物在生長習性，根系結構及根系分泌物組成方面均有很大的區別。觀察盆栽條件下這幾種江西特色盆景樹種根際微生物的差異與變化，希望能從根際微生物調控方面找到一些改善盆景樹種生長、提高觀賞價值的新途徑。

1材料與方法

1.1樣品采集與處理

供試植物為江西農業大學花卉盆景教學基地栽培的三葉赤楠、火棘、雞爪槭、三角楓和金邊瑞香盆樁，樹齡30~50a不等，但上盆栽培時間均為5a，且每樹種所取個體樹齡相仿。各品種盆樁管理方式一致，施用肥料以充分發酵的餅肥為主，施用量一致。

按照劉瑋等[4]的方法，每樹種取三株個體的根際土壤混合，揀去植物殘體，在田間含水量條件下過2mm篩，在-20℃條件下冷凍保存，以備后續DNA提取及相關分子生物學分析使用。

1.2土壤DNA提取及PCR擴增

盆景植物由于其養護方式，土壤多呈褐色及棕色，腐殖質類物質含量較高，而土壤中較多的腐殖質對于后續的PCR反應具有抑制作用，因此本試驗土壤樣品在提取DNA前要先進行脫腐洗滌[4]，洗滌后的土壤樣品DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil(Bio 101，Carlsbad，CA，USA)試劑盒按照說明書從0.5 g土壤樣品中進行提取。提取后的土壤DNA采用NanoDrop ND-8000(NanoDrop，Wilmington，USA)微量分光光度計進行濃度及質量測定。在本試驗中，采用細菌特異性引物GC-338F和518R進行PCR擴增[9]，目標DNA片段長度約為340 bp。PCR反應體系及條件按照劉有勝等[10]以及劉瑋等[4]的方法并加以改進。PCR反應產物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測后具有明顯目標條帶的PCR產物用QIAquick PCR產物純化試劑盒(TIANGEN，Beijing，China)純化后保存于-20℃待用。

1.3聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳分析(PCR-DGGE)

采用美國伯樂(Bio-Rad)公司的DcodeTM的基因突變檢測系統對不同盆景植物根際土壤PCR反應產物在1×TAE的電泳緩沖液中進行電泳分離，凝膠變性梯度為30%~65%，電泳溫度為60℃，電壓130 V電泳時間12 h。電泳結束后用SYBR GreenⅠ核酸染料染色30 min，在清水中退染20 min，然后用Bio-Rad Gel Doc2000凝膠成像系統觀察結果并拍照。采用Quantity One 2.0(Bio-rad，USA)軟件對根際土壤微生物群落的PCR-DGGE圖譜進行分析，在去除背景噪音后檢測不同樣品電泳條帶的數量和亮度峰值，通過圖像分析軟件分析凝膠圖像數字化后16S rRNA基因的指紋圖譜。

1.4數據分析及統計

本研究中，根際土壤細菌群落的物種豐富度(S)、Shannon-Weiner多樣性指數(H′)以及均勻度指數(E)用來表征樣品中細菌類群的多樣性狀況[11]。物種豐富度S以DGGE譜圖中有效條帶的數量(經過校正)，均勻度指數E表征不同樣品根際土壤群落中條帶的均勻度情況，即各細菌類群之間的分配情況。

排序分析及假設檢驗都用CANOCO for windows v.4.5軟件完成[12]，數據在進行PCA分析時沒有進行轉換。

2試驗結果

2.1不同盆景植物根際微生物群落PCR-DGGE分析結果

經過脫腐洗滌后，減少了胞外DNA和腐殖質類物質的污染與干擾，土壤DNA的提取效果較好，所提取的土壤DNA條帶明亮、清晰，經純化后可直接用于PCR擴增。PCR擴增產物片段長度約為340 bp，無引物二聚體和非特異性擴增。變性梯度凝膠電泳圖譜分析表明，PCR-DGGE方法對于盆景樹種的根際細菌類群具有很高的分辨率，不同盆景樹種根際土壤DNA樣品經DGGE電泳后分離出不同數量、強度和位置的條帶，代表著具有不同16S rDNA序列解鏈特性的細菌類群[13]，條帶越多證明細菌類群越多。經過變性梯度凝膠電泳，雞爪槭樣品分離出的條帶數最多，為26條；其次是三角楓和金邊瑞香，為19條；火棘樣品和三葉赤楠樣品的條帶數較少，只有3條和5條。不同盆景植物樣品根際土壤DNA的電泳條帶強度及遷移率也存在一定程度差異，表明樹種差異是造成盆景植物根際細菌群落種群變化的主要原因。

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)被用來描述不同盆景植物土壤樣品中細菌類群的分布特征(如圖1所示)，PCA分析結果表明盆景植物種類對土壤細菌群落具有顯著的影響，不同盆景植物根際土壤細菌群落出現了明顯的位置分化，在橫軸上主要是由槭屬的雞爪槭、三角楓和桃金娘科的三葉赤楠、薔薇科的火棘根際微生物差異所導致，而在縱軸上的差異則主要由瑞香科的金邊瑞香構成：在三葉赤楠(Sg)和火棘(Pf)周圍土壤細菌條帶很少，說明這些植物根際土壤中微生物的類群相對較少；雞爪槭(Ap)和三角楓(Ab)距離相對較近，在它們周圍的條帶也相近，如6、7、8、9、11、13、15、16、21、25、29、30，說明這兩種盆景植物的根際微生物類群組成較為接近，相同的微生物類群較多。金邊瑞香(Do)的根際土壤微生物類群與其他盆景植有很大區別。說明不同盆景植物根際微生物組成有很大的差異，基本可以分為三部分，其中Ap和Ab根際微生物類群組成較為相近，Sg和Pf根際微生物類群很少，而Do的組成與這兩部分也有很大差異。

圖1　微生物群落遺傳多樣性的主成分分析(Sg-三葉赤楠；Pf-火棘；Ab-三角楓；Ap-雞爪槭；Do-金邊瑞香)；圖中數字代表不同的微生物類群(不同條帶類型)。Fig.1 PCA analysis of soil microbial communities(Sg-Syzygium grijsii；Pf-Pyracantha fortuneana；Ab-Acerbuergerianum；Ap-Acer palmatum；Do-Daphne odora)；different microorganisms groups representby banding type were showed by numbers in figure.

2.2盆景植物對根際土壤微生物群落豐富度及多樣性特征影響

盆景植物種類對根際土壤細菌群落多樣性特征的影響不同(見表1)：不同盆景植物根際土壤細菌群落的豐富度及多樣性特征發生了明顯變化，雞爪槭(Ap)的物種豐富度及多樣性指數最高，分別為26和3.121；三角楓(Ab)和金邊瑞香(Do)的物種豐富度及多樣性指數數值接近次之，分別為19(Ab)、19(Do)和2.876(Ab)、2.873(Do)；火棘(Pf)的物種豐富度和多樣性指數最低，只有3和1.038。

表1　不同盆景植物根際土壤細菌群落多樣性特征

3討論

以往對于盆景植物的研究多著重于造型修剪以及栽培技術，關于栽培生理方面的研究極少，而對于盆景植物根際微生態的研究幾乎沒有。根際微生物是植物-土壤微生態系統的重要組成部分，在植物養分循環過程中起著重要的作用[14-15]。因此通過根際微生物的研究可以了解盆景植物-土壤微生態系統的協同關系，為盆景植物的高效培育提供依據[16]。

物種多樣性是指群落中物種數目的多少，它是衡量群落規模和重要性的基礎。種類越多，各種個體數量分布越均勻，物種多樣性指數越大。在DGGE圖譜中，每一個DGGE條帶代表的并不是一種微生物，而是一類微生物[17]。本研究被分離的每一個條帶代表樣品微生物群落中的一個細菌類群，條帶的深淺則代表了這種細菌類群的多少和豐富程度[18]。不同植物類型對于根際微生物類群影響也不相同，雞爪槭的多樣性指數最高，為3.121；三角楓和金邊瑞香次之，為2.876和2.873；火棘的多樣性指數最低，只有1.038(表1)。雞爪槭樣品條帶數最多，為26條；其次是三角楓和金邊瑞香，為19條；火棘樣品的條帶數最少，為3條。供試樣品間具有許多共同的條帶，說明不同植物間存在一些共有的微生物類型。這些公共條帶的強度也各不相同，表明不同植物間相同微生物類群在數量水平上也有區別。不同盆景植物的根際微生物類群及數量不同，有可能是受植物凋落物分解及植物根際分泌物的影響。在之前的一些研究中發現在盆栽試驗中混入土壤的凋落物對于根際微生物的群落結構產生了顯著影響[19]。但是由于盆景植物的特殊養護手段，凋落物幾乎不會在土表存留，因此對盆景植物根際微生物群落來說，根系分泌物的種類和數量可能影響更大，并可能對根際微生物的生長繁殖及代謝過程產生影響[219。例如有研究表明茄科植物番茄的根際分泌物對叢枝菌根真菌Gigasporagigantean和Gigasporaintraradices的菌絲生長有很大的影響[20]。根系分泌物不但對微生物的生物量產生積極作用，并且對微生物群落的構成產生重要影響。例如隨著小麥(Triticumaestivum)生長過程中根系分泌物的增加，根際環境中反硝化細菌的數量明顯增加[21]，另外小麥根系分泌物中的酚酸還具有抗菌性，對于根際微生物還具有一定的篩選作用[22]。

根際微生物群落物種豐富度及多樣性指數最高的雞爪槭(Ap，26和3.121)、三角楓(Ab，19和2.876)都是槭樹科槭屬植物，而最少的火棘(Pf，3和1.038)是薔薇科火棘屬植物，因此不同植物種屬間根系分泌物的差異可能是造成根際微生物群落差異的原因，相近種屬植物間根際微生物相似性較高。有研究對薔薇科4種灌木：Adenostomcisparsifolium(下文簡稱As)、Cowaniamexicanavar.glaber(Com)、Cercocarpusmontanusvar.glaber(Cem)、Fallugiaparadoxa(Fp)的根系分泌物進行研究發現它們共同的主要分泌物為三萜酸類而它們之間又各自有一些差異：其中As和Com的分泌物主要為黃酮苷，As還分泌齊墩果酸；Cem和Fp的分泌物主要為類黃酮化合物[23]。有研究表明冬青科植物細葉冬青(Ilexintegra)中的三萜酸類化合物對細菌和真菌具有抑制作用[24]。火棘的根際微生物的生物類群少的特性可能和三萜酸的分布有關。雞爪槭和三角楓為親緣關系較近的樹種，它們之間的根際分泌物在某種程度上，具有一定的相似性，這也導致二者之間的根際微生物相度較高。

根際微生物群落的動態變化也對根際生態系統的物質循環和能量流動產生著反饋作用，從而影響植物的生長發育及植被多樣性變化[25]。不同的盆景樹種，其地上的生長和地下微生物之間存在著不同的互動規律，有研究表明三葉赤楠隨著栽培時間的增加，土壤微生物多樣性增加，在第4年時其地下微生物多樣性最高，在第8年時又有所降低，這就能為三葉赤楠養護期間的換盆時間提供更多的依據[4]。更多的盆景植物的地上部分和地下微生物之間互動的關系和規律還有待進一步的探索。如果能夠充分了解其規律，且對盆景植物的栽培管理時能把其地下微生物的情況納入到考慮的因素之中，則能夠使植物的生長更加健壯，使其觀賞效果大大提高，達到事半功倍的效果。

【參考文獻】

[1]賈祥云，李峰，賈曼.中國盆景起源研究--中國盆景藝術形成于魏晉南北朝[J].中國園林，2004(7)：51-53.

[2]胡挺進，彭春生.盆景風格因子初探[J].北京林業大學學報(社會科學版)，2003，2(3)：54-57.

[3]范鶴鳴.桂花盆景不開花或開花少的原因及對策[J].花木盆景(花卉園藝)，2014(8)：42-44.

[4]劉瑋，張嘉超，鄧光華.不同栽培時間三葉赤楠根際微生物多樣性及其PCR-DGGE分析[J].植物研究，2010，30(5)：582-587.

[5]Brookes P C，McGroth S P.Effects of metal toxicity on the size of soil microbial biomass[J].Journal of Soil Science，1984，35：341-346.

[6]Faam D L，Whipps J M，Lynch J M.The use of colony development for the characterization of bacterial communities in soil and on roots[J].Microbial Ecology，1993，27：81-97.

[7]Muyzer G.DGGE/TGGE：a method for identifying genes from natural ecosystems[J].Current Opinion in Microbiology，1999，2：317-322.

[8]Tian H，Drijber R A，Zhang J L，et al.Impact of long-term nitrogen fertilization and rotation with soybean on the diversity and phosphorus metabolism of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi within the roots of maize(Zea mays L)[J].Agriculture Ecosystems & Environment，2013，164：53-61.

[9]Li A J，Yang S F，Li X Y，et al.Microbial population dynamics during aerobic sludge granulation at different organic loading rates[J].Water Research，2008，42：3552-3560.

[10]劉有勝，楊朝暉，曾光明，等.PCR-DGGE技術對城市餐廚垃圾堆肥中細菌種群結構分析[J].環境科學學報，2007，27(7)：1-6.

[11]Magurran A E.Ecological Diversity and its Measurement[M].Princeton：Princeton University Press，1988.

[12]Braak C J，Smilauer P.CANOCO Reference Manual and CanoDraw for Windows user’s guide：software for canonical community ordination(version 4.5)[M].Biometris，Wageningen，2002.

[13]Konstantinov S R，Zhu W Y，Williams B A，et al.Effects of fermentable carbohydrates on piglet facial bacterial communities as revealed by 16S ribosomal DNA[J].Fems Microbiology Ecology，2003，43：225-235.

[14]周麗霞，丁明懋.土壤微生物學特性對土壤健康的指示作用[J].生物多樣性，2007，15：162-171.

[15]Miah M Y，Kanazawa S，Chiu C Y，et al.Microbial distribution and function across wheat rhizosphere with oxamide and ammonium sulfate as N sources[J].Soil Science and Plant Nutrition，2000，46：787-796.

[16]吳林坤，林向民，林文雄.根系分泌物介導下植物-土壤-微生物互作關系研究進展與展望[J].植物生態學報，2014，38(3)：298-310.

[17]Sekiguchi H，Tomioka N，Nakahara T，et a1.A single band does not always represent single bactedal strains in denaturing gradient gel electrophoresis analysis[J].Biotechnology Letters，2001，23：1205-1208.

[18]Murray A E，Hollibaugh J T，Orrego C.Phylogenetic composition of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16SrDNA fragments[J].Applied Environmental Microbiology，1996，62：2676-2680.

[19]Singh G，Mukerji K G.Root exudates as determinant of rhizospheric microbial biodiversity[A].In：Mukerji KG，Ma-noharachary C，Singh J eds.Microbial Activity in the Rhizosphere[M].Berlin：Springer，2006.

[20]Gadkar V，David-Schwartz R，Nagahashi G，et al.Root exudate of pmi tomato mutant M161 reduces AM fungal proliferation in vitro[J].Fems Microbiology Letters，2003，223：193-198.

[21]王樹起，韓曉增，喬云發.根系分泌物的化感作用及其對土壤微生物的影響[J].土壤通報，2007：38(6)：1219-1226.

[22]Wu H W，Haig T，Pratley J，et al.Allelochemicals in wheat(Triticum aestivum L.)：cultivar difference in the exudation of phenolic acids[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2001，49：3742-3745.

[23]Wollenweber E，Henrich B，Mann K，et al.Lipophilic exudate constituents of some Rosaceae from the Southwestern USA [J].Zeitschrift fur Naturforschung，1996，51：296-300.

[24]孫備.細葉冬青中抗微生物作用的三萜類化合物及其抗真菌作用機理[J].國際中醫中藥雜志，2000，22(2)：102-103.

[25]Bardgett R D.The diversity of life in soil.In Bardgett RD ed.The Biology of Soil.A Community and Ecosystem Approach[M].New York：Oxford University Press，2005.

Comparison of Rhizosphere Microbial Characteristicsof Five Different Bonsai Plants

Mao Kuncai1，2，Zou Guiwu1，Deng Guanghua1，Liu Wei1*

(1.College of Art and Landscape，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045；

2.Training Center of Forestry Cadres，Forestry Department of Jiangxi Province，Nanchang 330045)

Abstract：The polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)method was used to determine the rhizosphere microorganism diversity of five bonsai species includingSyzygiumgrijsii，Pyracanthafortuneana，Acerbuergerianum，Acerpalmatum，andDaphneodora.The results showed that the rhizosphere microorganism had significant differences among the five bonsai species.Electrophoresis lanes obtained by PCR-DGGE were able to reflect the difference.Soil microorganism diversity were higher inAcerpalmatumandAcerpalmatum，with peak diversity index of 3.121 and 2.876，they also had a higher similarity of rhizosphere microbial community.The lowest diversity index was observed inPyracanthafortuneana，and the value was 1.038.These differences in rhizosphere microbial communities may be caused by root exudate secreted from different bonsai plants.Higher similarity of rhizosphere microbial community fromAcerpalmatumandAcerpalmatummay be due to their close phylogenetic position(Aceraceae，Acer).A lower rhizosphere microbial diversity inPyracanthafortuneanamay be due to the root exudate secreted by Rosaceae plant，which contained substances triterpene acids and had inhibitory effect on microorganism.

Keywords：bonsai species；rhizosphere microorganism diversity；PCR-DGGE analysis

*通信作者：劉瑋，講師，博士，E-mail: w_liu08@163.com

作者簡介：第一毛坤財，工程師，碩士研究生，主要從事園林植物與觀賞園藝學相關研究工作。

基金項目：國家自然科學基金(31400528)；江西省自然科學基金(20151BAB214018)資助

收稿日期：2015-10-11

中圖分類號：S 688.1；S 154.3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-005X(2016)01-0033-04