HOXB6在裸鼠大腸癌肝轉移模型抑癌機制的實驗研究

張曉微，王藝，趙雪峰

(大連大學附屬新華醫院普通外科，遼寧大連116021)

HOXB6在裸鼠大腸癌肝轉移模型抑癌機制的實驗研究

張曉微，王藝，趙雪峰

(大連大學附屬新華醫院普通外科，遼寧大連116021)

目的研究HOXB6在裸鼠大腸癌肝轉移模型抑癌機制及其前臨床意義。方法采用基因重組質粒pcDNA6-HOXB6轉染的HT29大腸癌細胞株建立裸鼠肝轉移模型，隨機分為兩組，即HOXB6組和對照組。制模30 d后觀察兩組間轉移瘤形成情況及生存情況。結果HOXB6組平均體質量、肝質量、肝轉移評分及血性腹水生成率明顯低于對照組，差異均有統計學意義(分別為20.04 g與23.08 g，P＜0.01；1.54 g與2.22 g，P＜0.01；0.60與3.80，P＜0.01；0與80.0%，P＜0.05)；兩組生存曲線分析顯示，HOXB6組生存率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論HOXB6可抑制裸鼠大腸癌肝轉移的形成，且可作為腫瘤轉移的評判指標。

HOXB6；裸鼠；大腸癌；肝轉移

同源盒基因(HOX基因)是調節胚胎的發育和分化的主宰基因，近期研究報道其對胃腸道惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用[1]。其中，HOXB6與大腸癌的發生、發展和轉移有關[2]。同時，還深入到大腸癌患者的早期診斷、術前分期判斷及預后的評估中[3]。但真正推廣于臨床腫瘤標記物，有待于大樣本的調查和前臨床試驗作為鋪墊。本研究首次采用裸鼠大腸癌肝轉移模型來探討HOXB6的抑癌機制及其前臨床試驗中的意義，進一步明確HOXB6在大腸癌肝轉移中的地位，以期為制備HOXB6相關抗體來針對大腸癌進行敏感性靶向治療和腫瘤的預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料HT29人大腸癌細胞株購自美國ATCC細胞研究所。轉染基因重組質粒pcDNA6-HOXB6及pcDNA6-scramble的大腸癌細胞由大連大學附屬新華醫院中心實驗室完成。RPMI-1640和新生胎牛血清購自Invirtogen，10只6周齡雌性BALB/c裸鼠購自大連醫科大學動物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及懸液制備常規無菌培養已轉染的HT29人大腸癌細胞株，細胞融合至90%以上時收集細胞并在顯微鏡下計數，調整至細胞濃度為5×107/ml。細胞混懸液置于冰中待接種。

1.2.2 模型設計實驗動物購入后在模型前1周防止進行任何刺激性操作。裸鼠共10只，隨機劃分成HOXB6組5只和對照組5只，制模后觀察4周。

1.2.3 大腸癌肝轉移模型的建立[4]選擇異氟醚進行全身麻醉。取5 mm小切口入腹后輕輕牽出大網膜和脾臟。選擇脾臟被摸中點，采用G31注射器進針2 mm左右，穩定注入已轉染的HT29人大腸癌細胞混懸液100 μl，止血紗布壓迫注射部位前可見其周圍有顏色改變及腫脹。數分鐘后離斷脾臟動靜脈，從腹腔中移除脾臟，逐層關腹。

1.2.4 大腸癌肝轉移評分標準肝轉移評分標準如下，0：沒有肝轉移；1：肝臟浸及為輕微，浸潤范圍＜0.5 cm2；2：肝臟浸及為輕度，浸潤范圍0.5～1.0 cm2；3：肝臟浸及為中度，浸潤范圍1.0～2.0 cm2；4：肝臟浸及為重度，浸潤范圍2.0 cm2以上。

1.2.5 實驗觀察指標及項目每天常規觀察并記錄裸鼠的一般狀態。裸鼠出現頻死前癥狀或觀察期滿4周時予以處死。處死后立即解剖觀察腹腔內轉移癌情況，具體記錄裸鼠的體質量、肝質量、肝轉移評分及是否存在血性腹水等，移除之肝轉移病灶采取病理檢查。

1.3 統計學方法應用SPSS14.0統計軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗、計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HOXB6對裸鼠大腸癌肝轉移模型的轉移癌形成情況HOXB6組平均體質量、肝質量、肝轉移評分及血性腹水生成率顯著少于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.01或P＜0.0)，見表1。大體觀及纖維鏡下結果顯示，HOXB6組轉移癌浸潤生長緩慢，但對照組轉移癌的肝內轉移和局部浸潤生長迅猛，見圖1。

表1 兩組裸鼠大腸癌肝轉移模型的轉移癌形成情況比較(±s)

表1 兩組裸鼠大腸癌肝轉移模型的轉移癌形成情況比較(±s)

組別肝轉移分級無有體質量(g)肝質量(g) HOXB6組對照組檢驗值P值20.04±0.86 23.08±0.63 t=5.403 0.006 1.54±0.11 2.22±0.08 t=8.552 0.001 0.60±0.15 3.80±0.45 t=10.251 0.006 5(100.0) 1(20.0) 0(0.0) 4(80.0) χ2=6.667 0.016

圖1 裸鼠大腸癌肝轉移模型的HOXB6組和對照組在大體肉眼上和顯微鏡下改變。大體上主要觀察有無血性腹水、腹膜種植轉移及肝轉移評分；顯微鏡下主要觀察癌細胞的分布，放大倍數為100倍，其刻度標尺為100 μm.

2.2 HOXB6對裸鼠大腸癌肝轉移模型的生存率情況每天觀察裸鼠一般狀態，飼養4周成功模型共10只，死亡5只。其中HOXB6組平均生存時間為3.94周，對照組平均生存時間為2.40周。HOXB6組累計生存率為80%(4/5)，對照組累計生存率為20%(1/5)。Live tables證實，HOXB6組4周累計生存曲線明顯高于對照組，兩組間比較差異有統計學意義(P=0.034)，見圖2。

圖2 HOXB6組和對照組裸鼠大腸癌肝轉移模型的累計生存曲線

3 討論

在大腸癌患者中肝轉移非常常見，手術仍是最有效的治愈手段。然而，80%～90%的絕大多數肝轉移灶在起初時是無法根治性切除的，故肝轉移成為了大腸癌患者最主要的死亡原因[5]。隨著分子生物學的進步，越來越多與大腸癌相關的生物標記物陸續被發現。在轉移性大腸癌患者的治療中添加生物靶向治療，可使一部分患者獲益，如何篩選這部分患者成為深受關注的話題[6-7]。但這一重要的課題遠遠滿足不了疾病的多樣化、異常化、變異化趨勢。因此，新的腫瘤標記物的發現和腫瘤預防制劑的研發，對癌腫的防治皆為關鍵。

HOX基因是轉錄調控或多種生長因子通路的樞紐因子，可調節腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡。近年來，對HOX基因的研究主要集中于發育過程中，而對于HOX家族的39個成員的前臨床和亞臨床的研究仍處于起步階段，至今為止只有少量的證據提示HOX家族在腫瘤形成過程中的抑制或促進作用機制[8]。非常可惜的是，試圖對HOX基因應用于臨床，但對特異性HOX基因的變化被提示患者需要更加積極的診治方案[9]。其中，HOXB6為抑癌基因，是與人胃腸黏膜發育及形態成密切相關的基因[10]。已研究發現，HOXB6還與結腸癌的發生、進展和轉移有相關性。加上，HOXB6基因的檢測只需結直腸鏡活檢中的微量的標本，此為HOXB6基因研究添加了一個重要的砝碼。

癌腫遠處轉移具有高度的選擇性和較強的器官特異性，例如大腸癌易發生肝轉移和肺轉移[11]。大腸癌肝轉移機制的研究基礎依然是建立穩定的轉移模型。本研究選用了先天無胸腺和體內無T細胞的裸鼠，并選擇了經脾注射法。此法能使癌細胞有充裕的時間轉移到肝臟，并切除主要免疫器官之脾臟，也符合單向性肝轉移模型的構思，更有助于研究單純性肝轉移。

本研究結果顯示，HOXB6基因對大腸癌肝轉移模型有明顯的抑癌機制。對HOXB6組進行解剖觀察發現轉移性肝癌形成緩慢均衡，不伴有血性腹水及遠處轉移，且4周累積生存率明顯高于對照組。在HOXB6組肝轉移癌細胞的生長增殖能力鑒定中，發現其生長繁殖能力不抵于侵襲能力。另一種解釋方法是，雖然HOXB6組的肝轉移癌細胞具備較強的侵襲能力，可其生長增殖能力相比較差。我們的研究結果打破了傳統的轉移性腫瘤的生長主流，這一結局關系到HOXB6基因的抗轉移作用。至于相關的抑制轉移機理和具體的HOXB6基因傳導通路有待于更進一步深入研究。

綜上所述，HOXB6可抑制裸鼠大腸癌肝轉移的形成，并且可作為腫瘤轉移的評判指標。但有必要進行亞臨床研究來證實其量化效果，同時要不斷進行對HOXB6基因抗轉移作用機理的研究。

[1]Xue Y,Gu D,Ma G,et al.Genetic variants in lncRNA HOTAIR are associated with risk of colorectal cancer[J].Mutagenesis,2015,30 (2):303-310.

[2]Vider BZ,Zimber A,Chastre E,et al.Deregulated expression of homeobox-containing genes,HOXB6,B8,C8,C9,and Cdx-1,in human colon cancer cell lines[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,272 (2):513-518.

[3]袁暉,黃波,湛獻能,等.結直腸癌中同源異型盒基因(HOX)A5和B6表達的研究[J].中國現代醫藥雜志,2011,13(3):1-4.

[4]劉福全,王建,趙雪峰.裸鼠人異位移植胃癌肝轉移和腹膜轉移模型的實驗研究[J].大連醫科大學學報,2014,36(5):435-439.

[5]Waisberg J,Ivankovics IG.Liver-first approach of colorectal cancer with synchronous hepatic metastases:A reverse strategy[J].World J Hepatol,2015,7(11):1444-1449.

[6]Chen KF,Yen CC,Lin JK,et al.Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A(CIP2A)is an independent prognostic marker in wild-type KRAS metastatic colorectal cancer aftercolorectal liver metastasectomy[J].BMC Cancer,2015,15:301.

[7]夏翠鋒,李強,沈燾,等.不同分期大腸癌組織中VEGF、CEA、Endostatin的表達及其與肝轉移的關系[J].海南醫學,2015,26(12): 1722-1724.

[8]Kogo R,Shimamura T,Mimori K,et al.Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor prognosis in colorectal cancers[J].Cancer Res, 2011,71(20):6320-6326.

[9]Bhatlekar S,Addya S,Salunek M,et al.Identification of a developmental gene expression signature,including HOX genes,for the normal human colonic crypt stem cell niche:overexpression of the signature parallels stem cell overpopulation during colon tumorigenesis [J].Stem Cells Dev,2014,23(2):167-79.

[10]Beck F,Tata F,Chawengsaksophak K.Homeobox genes and gut development[J].Bioessays,2000,22(5):431-441.

[11]Aisu N,Yoshida Y,Ishii F,et al.A successfully resected case of recurrent lung and liver metastases of rectal cancer treated with XELIRI+ Bevacizumab therapy[J].Case Rep Oncol,2013,6(1):143-147. (收稿日期：2015-07-07)

Tumor-suppressive mechanisms of HOXB6 in nude mice models of liver metastasis of colon cancer.

ZHANGXiao-wei,WANG Yi,ZHAO Xue-feng.Department of General Surgery,Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116021,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo study the tumor-suppressive mechanisms of HOXB6 gene in nude mice models of liver metastasis of colon cancer and its preclinical significance.MethodsHT29 colon cancer cells transfected by recombinant vector pcDNA6-HOXB6 gene were used to establish nude mice models of liver metastasis of colon cancer.The models were divided into two groups:HOXB6 group and control group.The formation situation of metastatic tumor and the survival status of nude mice models in the two groups were studied 30 d after the establishment of models. ResultsThe mean body weight,liver weight,liver metastasis scores and bloody ascites rate of HOXB6 group were significantly less or lower than those in the control group(20.04 g vs 23.08 g,P＜0.01;1.54 g vs 2.22 g,P＜0.01;0.60 vs 3.80,P＜0.01;0 vs.80.0%,P＜0.05).Survival curves showed that the survival rate in HOXB6 group was significantly higher than that in the control group(P=0.034).ConclusionHOXB6 gene may inhibit the formation of liver metastasis of colon cancer in nude mices,and it can be regarded as an indicator for evaluating tumor metastasis.

HOXB6;Nude mice;Colon cancer;Liver metastasis

R-332

A

1003—6350（2016）01—0001—03

大連大學博士啟動基金項目(編號：20151QL019)

趙雪峰。E-mail：zhaoxuefeng74@hamail.net