硝酸鎵和多黏菌素B抑制耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長的作用

王浩平，鄭淑華，穆小萍，黃瑞玉，盧春敏

(1.廣東省人民政府機關門診部，廣東廣州510030；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東廣州511400)

硝酸鎵和多黏菌素B抑制耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長的作用

王浩平1，鄭淑華2，穆小萍2，黃瑞玉2，盧春敏2

(1.廣東省人民政府機關門診部，廣東廣州510030；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東廣州511400)

目的評價硝酸鎵和多黏菌素B對臨床分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長的抑制作用，分析其抗菌機制。方法采用微量稀釋法檢測硝酸鎵和多黏菌素B對20株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的抑制作用，觀察兩者聯合應用的抑菌情況。結果試驗菌株對硝酸鎵和多黏菌素B均敏感，硝酸鎵對試驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)均為16 μmol/L，多黏菌素B對試驗菌株的MIC均為≤2.0 μg/ml，兩者聯合應用對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長有協同抑菌作用。結論硝酸鎵和多黏菌素B對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有明顯抑菌效果，有望成為控制其蔓延感染有效的治療藥物，為臨床治療這類難治細菌感染提供藥物選擇。

硝酸鎵；多黏菌素B；碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌；抑制作用

碳氫霉烯類是治療鮑曼不動桿菌嚴重感染的主要藥物，近年來此類藥物的廣泛使用，使得鮑曼不動桿菌對碳青酶烯類的耐藥率不斷上升，給臨床治療帶來極大困難[1-2]，因而尋求一種有效的抗菌藥物或新的治療方法尤其重要。鐵離子是細菌生長的必須營養品，硝酸鎵可通過干擾細菌的鐵離子代謝而實現抑菌作用[3-4]，多黏菌素B對細菌外膜具有快速穿透性的特點，亦可輔助其他抗菌藥物穿透細菌外膜進入細菌細胞內[5]，以達到殺滅細菌的作用，本研究應用硝酸鎵和多黏菌素B作用于鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥株，觀察兩者是否對其有抑制生長的效果，以及兩者聯合應用的抑菌情況，探求能否將硝酸鎵和多黏菌素B作為一種臨床有效的抗菌方法。

1 材料與方法

1.1 菌株來源菌株來自廣東省婦幼保健院檢驗科2012年1月至2014年12月的臨床患者標本分離株20株，經法國生物梅里埃公司的VITEK2-compact鑒定系統和藥敏試驗鑒定并確定為碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌，菌株間沒有重復株。

1.2 試劑與儀器培養基胰酶大豆肉湯(TSB)購自美國BD公司產品，硝酸鎵購自Sigma-Aldrich公司，多黏菌素B購自美國Amresco公司，無菌96孔聚苯乙烯U型微量板為德國Greiner產品，酶標儀為Thermo M ΜLTISKAN MK3。

1.3 方法

1.3.1 硝酸鎵和多黏菌素B藥物濃度配制采用倍比稀釋方法，用TSB將硝酸鎵稀釋成一系列不同濃度，由高到低依次為64 μmol/L、32 μmol/L、16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L，用相同方法將多黏菌素B稀釋到濃度分別為8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。

1.3.2 硝酸鎵和多黏菌素B的抑菌活性檢測采用微量肉湯稀釋法，各試驗菌株接種TSB，37℃孵育8 h，用生理鹽水將菌液調至0.5麥氏比濁標準，再用TSB稀釋1:100，使含菌量為106CFU/ml，然后在無菌96孔聚苯乙烯U型微量板每孔接種100 μl菌液，設置上下復孔，第一孔加入無菌液培養基為空白對照，第二孔加入不含藥物菌液為陽性對照，第三孔至第八孔各孔加入上述配制好的藥物100 μl，使硝酸鎵藥物終濃度依次為32 μmol/L、16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L，多黏菌素B藥物終濃度依次為4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml、0.125 μg/ml，將微孔板震蕩1 min，使各孔內溶液混勻，加蓋并用膠紙密封以減少孵育過程中的蒸發，置濕盒內37℃培養24 h后檢測菌液OD600的值，觀察不同藥物濃度的抑菌情況，以試驗孔中無細菌生長的最低藥物濃度為該藥物的MIC值。

1.3.3 硝酸鎵和多黏菌素B聯合應用抑菌試驗采用微量肉湯稀釋法，在無菌96孔聚苯乙烯U型微量板每孔接種100 μl菌液，將上述配好的不同濃度的硝酸鎵和多黏菌素B兩種藥物按棋盤法設計，兩兩組合各加入50 μl，使得每個U型孔中含有不同濃度的硝酸鎵與多黏菌素B，及單獨含有不同濃度的單藥硝酸鎵與多黏菌素B，同時加入無菌液培養基設置空白對照孔，加入不含藥物菌液設置陽性對照孔，震蕩混勻，加蓋并用膠紙密封以減少孵育過程中的蒸發，置濕盒內37℃培養24 h后檢測菌液OD600的值，觀察硝酸鎵和多黏菌素B聯合應用對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的抑菌情況。

2 結果

2.1 硝酸鎵的抑菌活性結果顯示硝酸鎵有抑制各株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌生長的作用，各菌株的抑制效果無差異，抑制活性曲線呈現一致性，當硝酸鎵濃度＞16 μm/L時，基本檢測不到病原菌的存在，其MIC值為16 μm/L。菌液濃度監測變化趨勢見圖1。

圖1 硝酸鎵抑菌活性曲線

2.2 多黏菌素B的抑菌活性多黏菌素B能抑制各株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的生長，且抑菌效果接近，20株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對多黏菌素B的MIC值均≤2 μg/ml，MIC值分布情況為0.5 μg/ml 6株、1.0 μg/ml 12株、2.0 μg/ml 2株。抑菌活性曲線，見圖2。

圖2 多黏菌素B抑菌活性曲線

2.3 硝酸鎵和多黏菌素B協同抑菌作用結果顯示在碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌活性試驗中，硝酸鎵和多黏菌素B聯合應用能互相增強抑菌效果，當硝酸鎵終濃度為4 μmol/L，多黏菌素B終濃度為0.25 μg/ml時，基本檢測不到病原菌的存在，兩種藥物聯合應用的MIC值均比單藥MIC值小，曲線見圖3。

圖3 硝酸鎵和多黏菌素B協同抑菌作用曲線圖

3 討論

鮑曼不動桿菌是引起醫院內感染的重要病原菌，而碳氫霉烯類是治療鮑曼不動桿菌嚴重感染的首選藥物，但是，近年來隨著亞胺培南、美羅培南等碳青酶烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛應用，其耐藥率呈上升趨勢，文獻報道鮑曼不動桿菌耐碳青酶烯類抗菌藥物日益增多[1-2]，目前臨床針對此類耐藥菌株的抗生素治療手段極其有限，給臨床治療帶來嚴峻的挑戰。

鐵離子是鮑曼不動桿菌的重要營養品，可以保持菌體內各類酶的活性并產生細菌毒素，酶類的激活需要鐵離子的參與，如果缺乏鐵離子則酶的活性將受到影響，甚至影響細菌發揮毒性作用[3-4]，由此可見鐵對鮑曼不動桿菌來說非常重要，因此本文考慮將鐵離子去除而抑制細菌生長，抑制其發揮毒性作用，而硝酸鎵的鎵離子可以與鐵離子競爭，限制細菌對鐵的攝取和利用，干擾細菌鐵代謝途徑而抑制其生長，具有較強的抗菌作用。多黏菌素B是多粘芽胞桿菌產生的一組多肽類抗生素，主要通過破壞細菌的細胞膜，導致細胞膜內細菌主要物質外漏，影響核質和核糖體功能，具有較強的殺菌作用并且不容易產生耐藥性，多數文獻也報道多黏菌素B對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的生長有明顯抑制作用[5-6]。

本研究結果顯示硝酸鎵和多黏菌素B對各株臨床標本分離的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌有明顯的體外抑制生長作用，兩者同時作用于耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌，具有協同抑菌作用。硝酸鎵的鎵離子半徑和效價與三價鐵離子一樣，鮑曼不動桿菌的生物反應系統無法區分兩種離子，可以用鎵離子模仿三價鐵離子與細菌體內的各種酶結合，使到需要鐵離子激活的所有酶均不能正常激活而失去生物學功能，最終通過干擾細菌鐵離子代謝途徑實現其抑菌功能，從而抑制鮑曼不動桿菌的生長[7-8]。多黏菌素B通過破壞鮑曼不動桿菌的細胞膜，對細菌外膜具有快速穿透性的特點，導致細胞膜內主要物質外漏[9]，破壞鮑曼不動桿菌的生物功能，同時細胞膜破壞后，可輔助硝酸鎵穿透細菌外膜進入細菌細胞內，替換鐵離子，干擾細菌體內的鐵代謝途徑，使碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌菌體內大部分酶因不能正常激活而發揮不了作用，最終抑制細菌生長，表現出硝酸鎵和多黏菌素B兩者聯合使用的協同作用，同時可減少各自的使用量，降低藥物腎臟損害的程度，從而解決耐藥菌的治療問題。

目前鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥率呈現上升的趨勢，臨床治療也出現困難，本研究從另一個角度考慮如何治療耐藥的鮑曼不動桿菌的感染，硝酸鎵聯合多黏菌素B對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有明顯的協同抑制生長作用，有望成為控制其蔓延感染有效的治療藥物，為臨床治療這類難治細菌感染提供藥物選擇。

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Inhibitory effect of gallium nitrate and polymyxin B on the growth of carbapenem-resistant Acinetobacterbaumannii.

WANG Hao-ping1,ZHENG Shu-hua2,MU Xiao-ping2,HUANG Rui-yu2,LU Chun-min2.1.Outpatient Department,Guangdong Provincial People's Government,Guangzhou 510030,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the ability of gallium nitrate and polymyxin B for inhibiting the growth of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients,and to analyze their mechanisms.MethodsThe inhibitory activity of gallium nitrate and polymyxin B against 20 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains was tested by using microtiter plates.The activity of the combination of gallium nitrate and polymyxin B was also observed.ResultsThe tested strains were sensitive to gallium nitrate and polymyxin B.The minimum inhibitory concentration(MIC)of gallium nitrate was 16 μmol/L,and the MIC of polymyxin B was less than 2.0 μg/ml.Synergistic inhibitory effect for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii was observed when gallium nitrate and polymyxin B were applied in combination.ConclusionThe bacteriostasis of gallium nitrate and polymyxin B for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii was obvious.It could be used for controlling the infection of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii.

Gallium nitrate;Polymyxin B;Carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii;Inhibitory effect

R378

A

1003—6350（2016）01—0073—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.026

2015-08-21)

廣東省醫學科學技術研究基金(編號：A2013173)

王浩平。E-mail：489611421@qq.com