異源淋巴細胞免疫治療后反復妊娠丟失患者的外周血NK細胞變化

范格英，林蕓，湯小湄，趙楊，苗竹林

(1.廣東省人民醫院廣東省醫學科學院婦產科，廣東廣州510080；2.暨南大學第一附屬醫院婦產科，廣東廣州510632；3.廣東省計劃生育專科醫院廣東省計劃生育科學技術研究所生殖中心，廣東廣州510600)

異源淋巴細胞免疫治療后反復妊娠丟失患者的外周血NK細胞變化

范格英1，林蕓1，湯小湄2，趙楊1，苗竹林3

(1.廣東省人民醫院廣東省醫學科學院婦產科，廣東廣州510080；2.暨南大學第一附屬醫院婦產科，廣東廣州510632；3.廣東省計劃生育專科醫院廣東省計劃生育科學技術研究所生殖中心，廣東廣州510600)

目的觀察異源淋巴細胞免疫治療后反復妊娠丟失(RPL)患者的外周血自然殺傷(NK)細胞變化情況。方法選取2012年1月至2013年12月期間在我院門診就診的反復妊娠丟失并具備免疫治療適應證的患者30例(RPL組)，采用流式細胞術分析異源淋巴細胞免疫治療后其外周血NK細胞及亞群的變化，并以26例正常婦女做為健康對照組進行比較。結果異源淋巴細胞主動免疫治療前，RPL組患者外周血CD3-CD56+NK細胞比例明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，而其余亞群比例CD3+CD56+、CD56dimCD16+、CD56brightCD16-、CD56+CD69+比較則差異均無統計學意義(P＞0.05)；經過治療后，患者外周血CD3-CD56+NK細胞比例從治療前的(17.07±8.19)降為治療后的(10.02±7.32)，差異有統計學意義(P＜0.05)，而其余亞群比例治療前后比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論異源淋巴細胞免疫治療可能通過降低CD3-CD56+NK細胞比例促進再次妊娠的成功。

異源淋巴細胞免疫治療；NK細胞；反復妊娠丟失

近年來，妊娠丟失成為困擾人們的主要難題，尤其是不明原因的反復妊娠丟失，嚴重影響女性身心健康。目前研究認為妊娠猶如半同種異體移植，妊娠婦女對胚胎父系同種抗原呈低識別或低反應性，容易導致妊娠丟失的發生，通過免疫治療可使患者的妊娠丟失率得到有效的控制，并取得了較好的療效，但其作用機制尚不明了。筆者采用淋巴細胞免疫(Lymphocyte immunotherapy，LIT)治療反復妊娠丟失(Recurrent pregnancy loss，RPL)患者，觀察其治療后的外周血自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)亞群變化，探討有效的反復妊娠丟失治療手段，從而避免妊娠丟失的再次發生，減少患者的痛苦。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2013年12月期間在我院門診就診且自然流產兩次及兩次以上的反復妊娠丟失患者30例(RPL組)采用異源淋巴細胞免疫治療，所有入組患者均有生育要求，封閉抗體檢測陰性，工作及生活環境無污染[3]。排除導致妊娠丟失有關的遺傳因素、解剖學因素、內分泌功能紊亂、感染以及其他免疫性疾病；排除男方不育因素(要求配偶精液檢查正常，染色體核型分析無異常)。同時選取26例無不良妊娠史的正常體檢婦女作為健康對照組。

1.2 異源淋巴細胞免疫治療方法清晨少量進食，抽取配偶或第三方供血者抗凝靜脈血20 ml，無菌條件下用淋巴細胞分離液分離得到淋巴細胞，用生理鹽水反復洗滌，制備淋巴細胞液后在患者前臂內側或上臂外側處作皮內多點接種，2～3周后再次注射，共3～4次，可依據患者病情進行個體化調整。

1.3 流式細胞檢測所用實驗試劑及步驟FACS Calibur流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司生產，CD16 FITC、CD56 PE、CD3 PerCP、CD69 APC鼠抗人熒光單克隆抗體均購自美國BD公司，4℃避光保存。將流式專用試管按順序進行檢測項目和檢測標本編號，取抗凝外周血約50μl，依次加入抗體CD16 FITC 8～10μl、CD56 PE 8～10μl、CD3 PerCP 8～10μl、CD69 APC 2～4μl進行標記，搖勻，避光孵育15 min。裂解后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，離心棄上清，制備PBS懸液約350μl，上機檢測。

1.4 統計學方法應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者治療前的NK細胞亞群表型變化比較RPL組患者的外周血CD3-CD56+NK細胞比例明顯高于健康對照組(P＜0.05)，而CD56brightCD16-NK、CD56dimCD16+NK、自然殺傷T細胞(NKT)及活化NK細胞比例比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組受試者治療前的NK細胞亞群表型變化比較(±s，%)

表1 兩組受試者治療前的NK細胞亞群表型變化比較(±s，%)

組別RPL組(n=30)健康對照組(n=26) t值P值CD3-CD56+17.07±8.19 10.69±7.21 3.072 0.0033 CD3+CD56+5.57±4.37 5.90±3.88 0.297 0.7678 CD56dimCD16+88.12±9.99 87.06±8.14 0.431 0.6682 CD56brightCD16-3.50±2.90 3.79±2.87 0.375 0.7091 CD56+CD69+4.89±2.26 4.92±2.05 0.0517 0.9590

2.2 RPL淋巴細胞免疫治療后NK細胞亞群表型變化比較經過治療后，患者外周血CD3-CD56+NK細胞比例從治療前的(17.07±8.19)降為治療后的(10.02±7.32)，差異有統計學意義(P＜0.05)，而其余亞群比例治療前后比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表230 例RPL患者淋巴細胞免疫治療后NK細胞亞群表型變化(±s，%)

表230 例RPL患者淋巴細胞免疫治療后NK細胞亞群表型變化(±s，%)

時間治療前治療后t值P值CD3-CD56+17.07±8.19 10.02±7.32 3.515 0.0009 CD3+CD56+5.57±4.37 4.22±5.73 1.026 0.3091 CD56dimCD16+88.12±9.99 86.12±9.21 0.806 0.4234 CD56brightCD16-3.50±2.90 3.98±2.40 0.698 0.4877 CD56+CD69+4.89±2.26 4.11±2.49 1.270 0.2090

3 討論

3.1 妊娠免疫耐受機制以及反復妊娠丟失發生的免疫失衡機理妊娠丟失多數被認為是一種對異常染色體受精卵的自然淘汰現象，而反復妊娠丟失與散發性妊娠丟失則不同。研究發現常見妊娠丟失的原因包括遺傳、免疫、感染、解剖、內分泌等因素，但也有很多患者發病原因不明，被稱為原因不明反復妊娠丟失，研究報道原因不明反復妊娠丟失占反復妊娠丟失患者的40%～60%[1]，是目前臨床以及學術界關注的重點。隨著基礎免疫學及免疫遺傳學的發展，越來越多的研究發現絕大部分不明原因的反復妊娠丟失病因與母胎免疫調節紊亂有關。正常妊娠是一種半同種異體移植，胎兒與母體間存在免疫平衡關系，這種平衡有賴于妊娠婦女對妊娠半同種抗原所表現的一種免疫耐受，而正常的妊娠免疫耐受涉及諸多因素，其中任何一個環節出現異常，都有可能導致妊娠失敗。胚胎作為同種半異體移植物，攜帶的父系抗原表達在母胎交界的滋養細胞表面，通過探討胚胎獲得“免疫耐受”的機制，為尋找治療反復妊娠丟失乃至器官移植的有效方法提供更充分的理論依據[2]。從生殖免疫角度分析，妊娠的維持極其復雜，涉及諸多因素。近年來國內外學者的研究主要從以下幾個方面解釋反復妊娠丟失的發病機制，即封閉抗體、Thl/Th2平衡、NK細胞以及CD4+CD25+Treg細胞功能等方面，其中NK細胞的變化是目前研究的熱點。

3.2 反復妊娠丟失患者NK細胞的變化NK細胞屬于淋巴細胞譜系細胞群，占外周血淋巴細胞數量的10%～15%，是機體天然免疫系統重要的組成部分，是一類既不需要抗原刺激、又不需抗體參與即能殺傷某些靶細胞的非T非B類淋巴細胞，也就是說無需抗原預先致敏就自發殺傷靶細胞，因此，NK細胞有細胞毒性效應。針對反復妊娠丟失患者外周血免疫細胞的變化研究目前報道較多，研究認為，妊娠婦女外周血NK細胞升高可能會導致妊娠丟失[3]。同時NK細胞毒性、數量及活性增加與妊娠丟失有關，外周血高水平的NK細胞提示可能發生生化妊娠或妊娠丟失[4]。有些學者甚至提出采用外周血CD56+NK細胞所占比例作為妊娠結局的預測指標[5]。研究發現，正常情況下，早期妊娠NK細胞活性較未孕時明顯降低，表明減少NK細胞的比例和抑制其活性也許能阻止母體免疫系統對胎兒抗原的攻擊，從而維持正常妊娠。

3.3 異源淋巴細胞免疫治療對NK細胞變化影響反復妊娠丟失作為一種常見的病理妊娠，約占整個妊娠的10%～15%[6]。研究發現，父方淋巴細胞作為滋養層淋巴細胞交叉反應刺激抗原，使之產生抗丈夫異源淋巴細胞抗體，增大組織相容性抗原(HLA)的組織相容性。有學者提出，反復妊娠丟失是由于母體不能識別父方抗原，從而不能產生封閉抗體，導致胚胎被母體的免疫系統所排斥[7]，采用配偶或第三方異源淋巴細胞免疫治療誘導母體產生保護性封閉抗體，使胎兒免受母體免疫系統及子宮局部免疫組織的排斥與攻擊，維持正常妊娠。對同種免疫型反復妊娠丟失患者采用丈夫或第三方異源淋巴細胞進行同種致敏治療，抑制母胎間的細胞性免疫排斥反應減少妊娠丟失的發生。采取皮內注射丈夫的異源淋巴細胞治療復發性自然流產(RSA)患者，防止了胚胎被母體免疫系統的殺傷而發生妊娠丟失，使胎兒易于存活，妊娠成功率提高[8]，但其作用機制是否與降低NK細胞的數量以及活性有關，尚不明了。

近幾年對NK細胞亞群CD69+活化NK細胞，CD3+CD56+NKT細胞進行大量的研究。活化NK細胞直接反映了細胞的免疫活性，研究發現NKT細胞升高的患者，免疫功能出現異常，可能導致妊娠丟失，需要積極的干預治療[9]。本研究結果顯示，經異源淋巴細胞免疫治療后總的NK細胞顯著降低，與對照組比較差異有統計學意義。可見，異源淋巴細胞免疫治療能明顯降低NK細胞的比例，有利于妊娠維持。對NK細胞亞群進行分析則發現，異源淋巴細胞免疫治療并不能改變其亞群在NK細胞中的比例，而且治療后CD69+活化NK細胞及CD3+CD56+NKT細胞的比例也未發生明顯變化，是否與本研究病例少有關，值得進一步研究。

綜上所述，檢測NK細胞免疫表型變化有助于反復妊娠丟失患者病因分析，動態監測有利于觀察異源淋巴細胞免疫治療的療效，從而避免妊娠丟失的再次發生，減少患者的痛苦。

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R714.2

B

1003—6350（2016）02—0282—03

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2015-06-06)

廣東省社會發展科技“臨床醫學”重點課題(編號：2011A030400011)

范格英。E-mail：15019609910@163.com