不同補腎方對卵巢摘除術后骨質疏松大鼠Wnt信號表達的影響＊

陶 智，鄭小利，薛 莎，楊文強，馬 威＊＊

（1.武漢市新洲區人民醫院 武漢 431400；2.武漢科技大學醫院 武漢 430065；3.武漢市中西醫結合醫院中心實驗室 武漢 430030）

不同補腎方對卵巢摘除術后骨質疏松大鼠Wnt信號表達的影響＊

陶 智1，鄭小利2，薛 莎3，楊文強3，馬 威3＊＊

（1.武漢市新洲區人民醫院 武漢 431400；2.武漢科技大學醫院 武漢 430065；3.武漢市中西醫結合醫院中心實驗室 武漢 430030）

目的：比較3種補腎方對卵巢摘除骨質疏松大鼠Wnt通路β-Catenin mRNA表達的影響。方法：雌性SD大鼠70只，隨機分為假手術組、模型組、龜鹿二仙膠組、二仙湯組、補腎活血組、雌二醇組、仙靈骨葆組，每組10只。雙側卵巢摘除術復制骨質疏松模型，術后30天進行相應的給藥實驗，假手術組和模型組給予灌服等量的生理鹽水。12周后測定各組大鼠血清中I型膠原羧基端肽（β-Crosslaps）、I型前膠原氨基端延長肽（P1NP）含量；以雙能X線骨密度測定儀測定大鼠股骨的骨密度；用RT-PCR檢測右側股骨髓LRP5、Wnt2、β-Catenin mRNA表達，用Western blot方法檢測LRP5、Wnt2、β-Catenin蛋白表達。結果：與sham組比較，模型組股骨骨密度、血液PINP濃度、β-Catenin mRNA、LRP5 mRNA、Wnt2 mRNA表達均顯著降低（P＜0.01），β-Crosslaps濃度顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，3組中藥組骨密度、血液PINP濃度、LRP5 mRNA、β-Catenin mRNA、Wnt2 mRNA及蛋白表達顯著增高（P＜0.05），血液β-Crosslaps濃度顯著降低（P＜0.01），補腎活血組骨密度及β-Catenin mRNA及蛋白表達高于其他兩補腎方劑組。結論：補腎方通過Wnt信號通路促進去卵巢大鼠成骨細胞增殖而改善骨質疏松癥，補腎活血組方效果更為明顯。

骨質疏松 雙側卵巢摘除術 補腎 補腎活血 Wnt信號 β-連接蛋白

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是以骨組織顯微結構退化，骨量減少，骨脆性增加，骨折危險性增加的一種全身性骨病，主要臨床表現為疼痛、身長縮短，駝背、骨折等，與中醫的“骨痿”、“骨痹”相似。中醫學認為，骨與腎的關系最為密切，腎虛是骨痿及骨痹的主要病機，是骨質疏松的病機關鍵[1]。如《素問·宣明五氣篇》有言：“腎主骨”，《素問·痿論》有言：“腎主身之骨髓”，“腎藏精，主骨生髓，其充在骨”，可見補腎是骨質疏松癥治療的關鍵。本文比較滋補肝腎、滋陰補腎及補腎活血等3種補腎方藥對卵巢摘除大鼠骨質疏松癥療效的差異，并探討其對Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠70只，雌性，體質量230-270 g，購于湖北省實驗物研究中心[SCXK（鄂）2008-0005]，動物合格證編號：No.42000600000069。動物實驗完成于武漢市第一醫院SPF動物室內[SYXK（鄂）2008-0030]，湖北省動物設施使用證編號：No.00115584。動物室溫度20-22℃，濕度40%-70%，12 h-12 h晝夜交替，大鼠喂飼已輻照消毒的維持飼料（北京華阜康公司），自由飲去離子水。

1.2 實驗藥物

陽性對照藥物戊酸雌二醇片（法國DELPHARM Lille S.A.S.公司，批號：253A）在用前配制成0.02 mg·mL-1水溶液。陽性中藥對照仙靈骨葆膠囊（貴州同濟堂制藥有限公司生產，批號：1303041）。“龜鹿二仙膠”出自《醫便》，由鹿角膠500 g、龜板膠250 g、人參45 g、枸杞子90 g組成。“二仙湯”出自梁頌名《中醫方劑臨床手冊》，由仙茅9 g、仙靈脾9 g、巴戟天9 g、當歸9 g、黃柏6 g、知母6 g組成。“補腎活血方”出自我院名老中醫管競環教授經驗方，由鹿角膠15 g、巴戟天9 g、熟地9 g、續斷9 g、丹參9 g、黨參9 g組成。上述中藥材均購于湖北天濟中藥飲片有限公司，按傳統方法煎煮后濃縮為1.0 g·mL-1生藥的水煎液。以上藥液配制后冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器

意大利產GK Vnigamma plus compact雙能X線骨密度儀檢測骨密度；β-Crosslaps及PINP均為羅氏C601電化學發光儀電化學發光法檢測，試劑（羅氏公司，批號分別為00172416、 00172419）；引物合成于上海生工，PCR試劑（Fermentas公司）；抗體Wnt2（美國Santa Cruz公司，批號：SC-50361）、β-actin（美國Santa Cruz公司，批號：SC-130657）、LRP5（英國Abcam公司，ab187756）、β-catenin（美國Bioworld公司，批號：BS3603），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120116）用于動物麻醉，其他手術器械等。

1.4 實驗步驟

1.4.1 模型制備

上述動物隨機分為2組，造模組60只，行雙側卵巢摘除術[2]；假手術組10只，暴露卵巢組織并摘除卵巢旁脂肪組織。

1.4.2 動物分組及藥物干預治療

造模第31天時，將造模組60只動物按體重分層隨機分為6組（每組10只），為龜鹿二仙膠組（Guiluerxian Glue Group，GLEX group）、 二 仙湯組（Erxian Decoction Group，EX group）、補腎活血組（BSHX Group）、雌二醇組（Estradiol valerate Group，EV group）、仙靈骨葆組（XLGB Group）、模型組（Model Group），各治療組分別按0.01 mL·g-1劑量給于相應的藥物灌胃，模型組及假手術組（Sham Operation Group） 作為對照組，分別按0.01 mL·g-1劑量灌胃生理鹽水。連續給藥12周。

1.4.3 樣本采集

治療結束后，首先檢測骨密度，然后以10%水合氯醛麻醉，心臟采血后（分離血清備用），灌注生理鹽水300-500 mL，直至流出清亮液體。取右側股骨骨骺，-80℃冰箱保存備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 骨密度檢測

動物麻醉后四肢展開平置于雙能X線吸收測量儀平臺上進行BMD檢測。由華中科技大學附屬協和醫院核醫學科完成檢測。

1.5.2 骨代謝指標檢測

血清β膠原特殊序列（β-Crosslaps）、血清I型前膠原氨基端延長肽（Procollagen Type I aminoterminal Propeptide，PINP）含量于武漢市中西醫結合醫院檢驗部檢測。

1.5.3 Wnt2、LRP5及β-catenin mRNA的RT-PCR檢測

參照Trizol說明書提取各組大鼠右側股骨中骨髓的總RNA，逆轉錄后，進行RT-PCR，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀采集電泳圖像并分析各組條帶灰度，并以β-actin為內參照，計算各指標與內參的比值作為該指標的相對含量。

1.5.4 Western Blot法 檢 測 Wnt2、LRP5及·-catenin蛋白表達

組織按1:5比例加入裂解緩沖液，超速勻漿后以10 000 rpm·min-1的速度4℃離心50 min，取上清液；經蛋白定量后，調整使樣本蛋白濃度相同，沸水煮5 min變性；SDS-PAGE電泳，轉印至醋酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉封閉；分別加一抗Wnt2（1:1 000）、LRP5（1:3 000）、β-catenin（1:500）、β-actin（1:2 000）4℃過夜；加二抗室溫作用2 h；ECL顯色，以內參β-catin含量為參照，用IPP 6.0軟件對免疫印跡條帶的灰度值（光密度）進行半定量分析。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 各組動物股骨骨密度比較

如表1所示，與Sham組比較，Model組股骨BMD顯著降低（P=0.000）；與Model組BMD比較，EV組BMD顯著增高（P=0.003），XLGB組顯著增高（P=0.000），GLEX組顯著增高（P=0.000），EX組顯著增高（P=0.000），BSHX組顯著增高（P=0.000）；與EV組BMD比較，XLGB、GLEX及BSHX組顯著增高（P均為0.000）；與XLGB組比較，EX組顯著降低（P=0.007）；與BSHX組比較，GLEX及EX組顯著降低（P均為0.010）。這說明各治療組均能增加模型動物骨密度含量，且補腎活血中藥優于龜鹿二仙膠及二仙湯。

2.2 各組骨代謝指標比較

如表1所示，與Sham組比較，Model組β-Crosslaps含量顯著增高（P=0.000），PINP含量顯著降低（P=0.048）;與Model組比較，EV組β-Crosslaps顯著降低（P=0.008），XLGB組β-Crosslaps顯著降低（P=0.000），GLEX組β-Crosslaps顯著降低（P=0.001），EX組β-Crosslaps顯 著 降 低（P=0.000），BSHX組β-Crosslaps含量顯著降低（P=0.000），EV組PINP含量顯著增高（P=0.001），XLGB組PINP含量顯著增高（P=0.001），GLEX組PINP含量顯著增高（P=0.000），EX組PINP含量顯著增高（P=0.000），BSHX組PINP含量顯著增高（P=0.005）；與EV組比較，EX組β-Crosslaps含量顯著降低（P=0.002）、BSHX組PINP含量顯著增高（P=0.015）；與XLGB組比較，BSHX組PINP含量顯著增高（P=0.021）；與BSHX組比較，EV組PINP含量顯著降低（P=0.015），GLEX組與BSHX組之間β-Crosslaps沒有差異（P=0.155）。這說明各中藥治療組骨形成（骨膠原合成）增強顯著，其中補腎活血組骨形成作用優于二仙湯組，與龜鹿二仙膠組沒有差異。

2.3 股骨Wnt2、LRP5、β-catenin mRNA表達比較

Wnt2、LRP5及β-catenin mRNA擴增的引物序列及退火溫度見表2。經35個循環擴增后結果如表3所示（圖1），與Sham組比較，Model組Wnt2 mRNA表達顯著降低（P=0.000），LRP5 mRNA表達顯著降低（P=0.000），β-catenin mRNA表達顯著降低（P=0.000）；與Model組比較，EV、XLGB、GLEX、EX及BSHX組Wnt2mRNA表達均顯著增高（P均為0.000），β-catenin mRNA表達亦顯著增高（P均為0.000），XLGB、GLEX、EX及BSHX組LRP5mRNA表達顯著增高（P均為0.000）；與EV組比較，XLGB組Wnt2 mRNA表達顯著增高（P=0.001），GLEX組Wnt2 mRNA表達顯著增高（P=0.003），EX組Wnt2 mRNA表達顯著增高（P=0.001），BSHX組Wnt2 mRNA表達顯著增高（P=0.000），XLGB組LRP5 mRNA表達顯著增高（P=0.033），GLEX組LRP5 mRNA表達顯著增高（P=0.000），EX組LRP5 mRNA表達顯著增高（P=0.000），BSHX組LRP5 mRNA表達顯著增高（P=0.000），XLGB組β-catenin mRNA表達顯著增高（P=0.001），GLEX組β-catenin mRNA表達顯著增高（P=0.000），EX組β-catenin mRNA表達顯著增高（P=0.000），BSHX組β-catenin mRNA表達顯著增高（P=0.000）；與XLGB組比較，BSHX組LRP5及β-catenin mRNA表達均顯著增高（P=0.000，0.002）；與BSHX組比較，GLEX及EX組LRP5 mRNA表達顯著降低（P=0.000，0.000）。這說明補腎中藥通過上調Wnt經典通路中部分基因表達而促進骨質疏松癥的改善，以補腎活血組最明顯。

表1 各組動物BMD，β-Crosslaps，PINP比較（ n=10）（±s）

表1 各組動物BMD，β-Crosslaps，PINP比較（ n=10）（±s）

注：與sham組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與model組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與EV組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；與XLGB組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與BSHX組比較，□P＜0.05,□□P＜0.01。

F value（P） 7.702（0.000） 8.034（0.000） 35.935（0.000）

表2 PCR所檢測基因引物序列

表3 各組動物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表達比較（ n=8）（±s）

表3 各組動物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表達比較（ n=8）（±s）

注：與Control組比較，P＜0.05,**P＜0.01；與Model組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與EV組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；與XLGB組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與BSHX組比較，□P＜0.05,□□P＜0.01。

Group Wnt2 β-catenin LRP5 Sham 組 1.03±0.20 1.95±0.16 1.63±0.51 Model組 0.53±0.11** 1.05±0.18** 0.96±0.24**EV組 1.23±0.12## 1.62±0.17## 1.14±0.23 XLGB組 1.50±0.14##△△ 1.82±0.20##△ 1.62±0.19##△△GLEX組 1.48±0.15##△△ 2.06±0.17##△△▲□ 1.91±0.23##△△▲□□EX組 1.52±0.19##△△ 1.96±0.20##△△□ 1.51±0.18##△△□□BSHX組 1.58±0.20##△△ 2.32±0.20##△△▲ 2.63±0.22##△△▲▲F值（P） 44.520（0.000） 32.565（0.000） 30.448（0.000）

圖1 各組β-actin、Wnt2、β-catenin、LRP5 mRNA表達比較

2.4 股骨Wnt2、LRP5、β-catenin 蛋白表達比較

Western blot實驗結果（見表4、圖2）顯示，與Sham組比較，Model組Wnt2，β-catenin，LRP5顯著降低（P均為0.000）；與Model組比較，XLGB、GLEX、EX及BSHX組Wnt2蛋白顯著增高（P均為0.000），EV組β-catenin蛋白顯著增高（P=0.002），XLGB、GLEX、EX及BSHX組β-catenin含量顯著增高（P均為0.000），XLGB、GLEX，EX及BSHX組LRP5含量增高（P均為0.000）；與BSHX組比較，GLEX及EX組Wnt2含量顯著降低（P=0.001，0.000），β-catenin含量降低（P均為0.000），LRP5含量亦顯著降低（P均為0.000）。

3 討論

中醫學普遍認為腎虛為“骨痿”、“骨痹”的根本，其癥狀與現代醫學中的骨質疏松癥相似[3]。《醫經精義·臟腑所合》有言：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，腎之所合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足者骨強”，可見腎與骨的關系最密切。腎藏精，主骨生髓。骨精充足，骨髓生化有源，骨骼才得以滋養，若腎精虧虛，骨髓失養，則易出現骨質疏松。因此，補腎是治療骨質疏松癥的關鍵所在。作為先天之本的腎，如果功能失常，則骨骼失養，行血無力，易形成血瘀；而血瘀使骨髓不能得到滋養，髓少筋枯引發骨痿（骨質疏松）[4]，當治以溫腎陽、滋腎陰、活血化瘀。龜鹿二仙膠陰陽并補，氣血兼顧，方中鹿角膠溫腎壯陽益精補血，龜板膠填精補髓滋陰養血，人參補后天脾胃之氣，枸杞子益肝腎，補精血。二仙湯滋陰補腎，方中仙茅、仙靈脾、巴戟天溫腎陽，補腎精；黃柏、知母瀉腎火、滋腎陰；當歸溫潤養血，調理沖任。補腎活血方補腎活血，方中鹿角膠溫補肝腎益精養血，巴戟天、續斷補腎陽，強筋骨，熟地養陰填精益髓，黨參健脾益氣，丹參活血祛瘀生新。三方相較，龜鹿二仙膠重在陰陽并補，二仙湯在于補瀉結合，經驗方在于補腎活血。

表4 各組動物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2蛋白表達比較（ n=5）（±s）

表4 各組動物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2蛋白表達比較（ n=5）（±s）

注:與Sham組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與Model組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與EV比較，△P＜0.05,△△P＜0.01；與XLGB組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與BSHX組比較，□P＜0.05,□□P＜0.01。

Wnt2 β-catenin LRP5 Group Sham組 0.858±0.067 0.713±0.094 0.608±0.089 Model組 0.460±0.063** 0.326±0.080** 0.262±0.063**EV組 0.513±0.074 0.543±0.088## 0.362±0.084 XLGB組 0.794±0.105##△△ 0.820±0.083##△△ 0.671±0.098##△△GLEX組 0.836±0.111##△△□□ 0.814±0.082##△△□□ 0.577±0.107##△△□EX組 0.770±0.087##△△□□ 0.672±0.091##△▲□□ 0.547±0.119##△△□BSHX組 1.054±0.124##△△▲▲ 1.099±0.148##△△▲▲ 0.712±0.112##△△F Value（P） 24.507（0.000） 30.651（0.000） 24.507（0.000）

Wnt是一種分泌型、富含半胱氨酸的蛋白，Wnt信號通路十分保守，在各種生物之間其成員具有高度同源性[5]。研究表明，經典wnt/β-catenin信號途徑在成骨細胞分化增殖中發揮重要作用，LRP5作為Wnt的共同受體，Wnt蛋白與其胞外區結合，再與Fzd受體結合形成復合物而將信號從胞外傳導至胞內，在LRP5功能獲得性突變小鼠G171V中發現大量成骨細胞存在，且堿性磷酸酶表達和礦化能力也隨之增強[6，7]，成骨細胞膜上的LRP5作為Wnts的輔助受體可以誘導成骨細胞內的一系列信號傳遞，人類LRP5基因功能獲得性突變可引起骨密度增加，而其功能缺失性突變將引起骨質疏松-假神經膠質瘤綜合征的發生[8]。β-catenin是Wnt經典信號通路中的關鍵因子，它在Wnt信號通路被激活時與核內轉錄因子（TCG/LET）DNA結合改變DNA的結構，啟動下游靶基因轉錄，促進成骨細胞的分化與增殖。β-catenin基因缺失的動物I性膠原、骨鈣素表達的明顯減少，骨形成和骨礦化能力衰減[9]。絕經后骨質疏松主要是雌激素缺乏引起的，雌激素缺乏導致對破骨細胞有抑制作用減弱；除雌激素受體通路外，它也通過Wnt/β-catenin信號通路影響成骨細胞的增殖與分化。研究顯示在雌激素缺乏的動物模型中應用雌激素受體阻斷劑后，β-catenin表達降低，且成骨細胞標志物減少；另外在骨髓基質細胞ST-2體外培養環境中加入雌激素會引起骨保護素蛋白和mRNA表達增高，繼而抑制破骨細胞的分化與增殖[10，11]。

圖2 各組β-actin、Wnt2、β-catenin、LRP5 蛋白表達比較（Western Blot）

本實驗顯示，補腎方對骨形成有促進作用，這從去勢動物骨密度增加得到證明；三組補腎方β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表達均較模型組顯著增高（P＜0.01），說明均能通過Wnt經典通路改善去勢動物骨質疏松癥狀；補腎活血組骨密度高于二仙湯組和龜鹿二仙膠組（P＜0.05），且作為Wnt經典信號通路關鍵的β-catenin mRNA表達亦高于其他兩組（P＜0.01），提示補腎活血方能更好地通過Wnt經典通路改善去勢大鼠骨質疏松癥。本實驗結果僅來源于體內試驗，還需要更多的拆方及體外細胞學實驗闡明補腎活血方通過Wnt經典通路防治骨質疏松癥的機制。

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Effects of Different Prescriptions of Tonifying Kidney on Wnt Signaling in Ovariectomy-Induced Osteoporosis Rats

Tao Zhi1,Zheng Xiaoli2,Xue Sha3,Yang Wenqiang3,Ma Wei3
(1. Clinical Laboratory,Wuhan Xinzhou District People’s Hospital,Wuhan 431400,China; 2. Integrated Department,Hospital of Wuhan University of Science and Technology,Wuhan, 430060,China; 3. Center of Experimental Medicine,Wuhan Integrated TCM & Western Medicine Hospital,Wuhan,430022,China)

This study aimed to explore the effects of three differenct prescriptions of tonifying kidney on the expression of β-Catenin mRNA of Wnt signaling pathway in osteoporosis rats. In this experiment,70 female SD rats with the weight of 250±20 g were randomly divided into seven groups: the sham-operation group （the control group）,the model group,the Guilu Erxian glue group,the Erxian decocotion group,the torifying kidney and promoting blood flow treatment group （TCM group）,the estradiol treatment group （the E group） and Xianlin Gubao group,with 10 rats for each group. The osteoporosis model was established by bilateral ovariectomy. The control group underwent sham surgery,while the other six groups administered by bilateral ovariectomy. Rats had been given corresponding treatments for 30 days after the operation. And twelve weeks later,the femoral bone mineral density （BMD） was detected by dual-energy X-ray absorptiometry,and plasma type I collagen carboxy-terminal peptide （β-Crosslaps） and amino-terminal propeptide of type I procollagen （PINP）,the mRNA and protein expression of Wnt2,LRP5 and β-catenin extracted from the right femoral bone marrow weretested by RT-PCR and western blot,respectively. It was found that compared with the control group,BMD,plasma PINP level and the mRNA and protein expressions of Wnt2,LRP5 and β-Catenin in the model group were decreased significantly （P ＜ 0.01）,while the β-Crosslaps expression increased （P ＜ 0.01）. Compared with the model group,BMD,PINP and the mRNA and protein expressions of Wnt2,LRP5 and β-Catenin in the three groups treated by three different tonifying-kidney prescriptions were increased obviously （P ＜ 0.05）,while the expression of β-Crosslaps attenuated （P ＜ 0.01）,and the BMD,the mRNA expression of β-Catenin in the TCM group was higher than that in the Guilu Erxian glue group and the Erxian decocotion group. In conclusion,the three torifying-kidney related prescriptions may improve the state of osteoporosis through regulating Wnt signaling pathway. Thus,the osteoblast proliferation in osteoporosis rats was promoted by the prescription of tonifying kidney and activating blood circulation.

Osteoporosis,ovariosteresis,tonifying kidney,traditional Chinese medicine of enriching kidney and promoting blood flow,Wnt signaling pathway,β-catenin

10.11842/wst.2016.05.020

R68

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2015-12-15

修回日期：2016-03-07

＊ 武漢市衛生局中西醫結合課題（武衛[2005]294號）: 辨證論治與元素含量優化組方對骨質疏松癥干預的實驗研究，負責人：馬威。

＊＊ 通訊作者：馬威，副主任技師，主要研究方向：中藥藥理與分子生物學。