黃芪次生代謝研究進展＊

張開雪，劉振鵬，閆 嵩，任偉超，劉秀波，馬 偉

（黑龍江中醫藥大學藥學院 哈爾濱 150040）

黃芪次生代謝研究進展＊

張開雪，劉振鵬，閆 嵩，任偉超，劉秀波，馬 偉＊＊

（黑龍江中醫藥大學藥學院 哈爾濱 150040）

目的：黃芪為豆科植物，它的生物活性成分種類很多，且都有不同的藥理作用。黃芪內生真菌的報道很少，所以對它的研究才剛剛開始。植物次生代謝網絡復雜，利用誘導子提高植物特定代謝途徑的次生代謝產物的產量，對生物合成途徑進行調控。誘導子分為生物誘導子和非生物誘導子，而關于誘導子的作用機理，只有一個初步的假說，沒有作用機理的指導，篩選也較盲目。為了消除試驗的背景噪音，無土栽培方式在植物內生真菌及根際微生物研究中，消除了土壤菌群的影響。隨著新學科的產生和新技術的發展，組學技術、新一代測序技術應運而生，并在各個領域得到廣泛應用。

黃芪 次生代謝 誘導子 無土栽培 組學技術 新一代組學技術

《中國藥典》（2015版）規定，黃芪是蒙古黃 芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus (Bge.) Hsiao或 膜 莢 黃 芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，而蒙古黃芪是膜莢黃芪的變種。黃芪又稱戴糝、芰草、百木、黃耆，首載于中國古代第一部本草著作《神農本草經》，味甘，性微溫，歸肺、脾經，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效[1-6]。其基原為豆科黃芪屬Astragalus Linn.植物，多年生草本，全世界共有11個亞屬2 000余種，中國有8個亞屬278種[2]，廣泛分布于中國華北、東北、內蒙古和西北地區，主產于黑龍江、內蒙古、山西、遼寧、河北等地，是重要的北方藥材。

黃芪廣泛應用于臨床配方，具有強心、抗心肌缺血、提高免疫力、降糖、抗衰老、保護臟器等多種藥理作用[7，8]。黃芪中含有多種生物活性成分，包括多糖、皂苷、黃酮、氨基酸、亞麻酸、亞油酸、谷甾醇、葉酸及多種微量元素等，其中黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮等為其特征活性成分。黃芪多糖具有免疫調節、提高巨噬細胞活性、抗腫瘤等作用[9-13]。黃芪甲苷具有抗炎、鎮痛、降壓、鎮靜等藥理作用[14]。黃芪黃酮具有增強機體非特異性免疫及特異性體液免疫[15，16]、抗心肌缺血[17-22]、防護肝損傷[23]等藥理作用。

1 誘導子在植物次生代謝途徑研究中的應用

植物次生代謝網絡復雜，使人們通過不同的方法來刺激代謝途徑以增加目標次生代謝產物的合成量。目前，利用誘導子對目標次生代謝產物的生物合成途徑進行調控，已被看作是一種大幅度提高培養物中代謝產物含量的重要方法。誘導子能夠對植物的特定基因進行誘導表達，開啟相關的植物次生代謝途徑，積累目標次生代謝產物，從而提高植物特定代謝途徑的次生代謝產物產量。

1.1 誘導子的種類及應用

從植物病理學角度進行的定義，誘導子（Elicitor）是指能引起植物抗病生理過程，誘導植物產生植保素（Phytoalexin）并引起植物過敏反應（Hypersensive Reaction，HR）的因子[24]。誘導子是一類特殊的觸發因子，它能夠開啟代謝過程中酶的活性，因而能夠增加次生代謝物的含量，有時甚至可以誘導出新的化合物。誘導子根據來源可分為非生物誘導子（Abiotic Elicitor，AE）和生物誘導子（Biotic Elicitor，BE）。其中，AE以物理和化學因子引起誘導作用，BE是植物體在防御過程中為抵抗微生物感染而產生的有誘導作用的誘導子[25]。

1.1.1 非生物誘導子

非生物誘導子不是植物細胞中天然成分但又能觸發植物細胞形成抗毒素信號的物質。常見的非生物誘導子有乙烯（Ethylene，ET）、水楊酸（Salicylic Acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）、茉莉酸甲酯（Jasmonic Acid Methyl Ester， MeJA）、草酸（Oxalic Acid，OA）等，還有一些金屬離子和紫外光，這些因素均能誘導植物產生抗性，增強其次生代謝途徑[20]。外源性MeJA類化合物能有效刺激植物萜類、黃酮類、生物堿類等次生代謝物的生物合成[26-29]。SA可誘導紫杉醇含量的提高[30]，促進胞內過氧化物含量增加[31]。用Cu2+處理能增加紅豆杉培養細胞紫杉醇含量的提高[25]。紫外光能刺激胡蘿卜素、類黃酮、多酚和質體醌等次生代謝產物的形成[32]。

1.1.2 生物誘導子

生物誘導子是指植物體在防御過程中為對抗微生物感染而產生的物質，包括分生孢子、降解細胞壁的酶類、細胞壁碎片、有機體產生的代謝物。對于生物誘導子來說，目前應用最廣、研究最多的是真菌誘導子。真菌誘導子的特點是能快速、高度專一和選擇性的誘導植物特定基因的表達，從而活化相應次生代謝途徑，最后產生目標次生代謝產物[33，34]。自從1968年Crutckshand等首次對真菌誘導子進行了報道后，對真菌誘導子的研究對象有很多：將灰葡萄孢、灰黃霉素、大麗輪枝孢和融黏帶酶混合培養濾液作為誘導子來提高紫杉醇、紫杉堿的產量[35]，利用葡萄孢屬的真菌菌絲體勻化產物作為誘導子來提高罌粟血根堿的含量[36]，利用真菌誘導子提高紅豆杉細胞紫杉醇的含量[37-39]。

1.2 誘導子的作用機理及篩選

從目前的研究來看，誘導子對次生代謝途徑的調控具有專一性，對同一代謝途徑調控的誘導子具有多樣性。例如，真菌誘導子可快速激活百脈根的毛狀根中的苯丙氨酸氨基裂解酶（Phenylalanine Amino Lyase，PAL）合成異黃酮化合物，而對其它無直接關系的酶沒有明顯的作用；也有研究者發現用12種不同真菌菌絲體勻漿對長春花細胞懸浮培養，其吲哚生物堿含量和對照組比較均明顯提高[40，41]。而誘導子作用機理只有一個初步的理論假說：誘導子作為一種外界信號引起植物細胞膜上的受體位點識別，識別后兩者的結合引起細胞膜上及細胞內相關的生理生化連鎖反應，與植保素有關的酶活性發生改變，最終導致植保素的合成和積累。

由于沒有作用機理基礎理論的指導，使誘導子的篩選工作成為困擾研究者多年的一個難題，目前的篩選還停留在較盲目的嘗試階段。要想有效地利用誘導子來提高目標次生代謝產物的產量，就要對次生代謝途徑的關鍵酶及相應的誘導子進行具體研究，弄清楚兩者之間的調控關系，如此才能將“誘導子誘導-合成目標次生代謝產物”的整個鏈條貫穿起來。根據目標代謝產物的特征結構及其相應的生理功能選擇與之相應的誘導子，從而避免目前誘導子篩選工作的盲目性。

在真菌誘導子的研究中，也應加強誘導子的純化和結構分析，因為在研究真菌對次生代謝調控的影響時，往往使用的是多種菌體及其發酵液的混合物，在混合物中難以避免不同調控作用的誘導子之間起相互作用，這樣就可能會削弱或增強某個誘導子的調控程度，使其調控作用結果復雜而不穩定，為研究工作帶來困難。對真菌誘導子進行純化，能清楚的對其結構和功能做進一步的確定，這樣就能揭示真菌誘導子在植物次生代謝途徑中的調控機理。將結構和功能清楚的誘導子用于次生代謝產物的生產，提高目標次生代謝產物的產量。在具有相同生物產量的植株群體中生產出更多的目標次生代謝產物，自然資源利用率會大大提高，將會大大降低目標次生代謝產物的生產成本，它將帶來可觀的經濟、社會及生態效益。

2 黃芪內生真菌的研究現狀

黃芪為豆科黃芪屬多年生草本植物，和多數豆科植物一樣，黃芪和土壤根際微生物菌群的共生現象非常普遍。由于黃芪屬于藥用植物，相關研究多集中在藥理和病理方面，針對其內生真菌的研究較少，現有報道集中在近幾年，內容只涉及內生菌菌種的分離、內生真菌和寄主次生代謝物質相似性研究，并未將其作為誘導子用于黃芪次生代謝途徑的研究。因此，對黃芪內生真菌的研究處于起步階段。有研究從黃芪中成功分離出內生菌，經鑒定，這些內生菌一般具有抑菌活性。例如，從膜莢黃芪Astragalus membranaceus葉中分離得到一株瓶霉菌屬Phialophora sp.內生真菌，對常見的4種細菌有不同程度的抑菌活性[42]；從蒙古黃芪中分離并鑒定出7個菌屬28種內生菌菌株[43-44]；從恒山黃芪（屬于蒙古黃芪）中分離得到分屬于3目、6科、17屬的內生真菌菌株49株，其中有33株菌至少能抑制1種指示菌[45-47]。

3 無土栽培在根際微生物研究中的應用

為了消除試驗的背景噪音，研究者建立了各種試驗操作體系以消除不可控因素。早期研究溫度及光周期等因素對植物的影響時，科研工作者使用了人工氣候室進行試驗；在研究基因功能過程中，科研人員利用全基因組測序遺傳背景清楚的模式植物，并建立了組織培養體系以及細胞懸浮體系，這些手段都在具體研究中起作用，并得到了相應的成果。例如，利用細胞懸浮體系建立的細胞發酵工程工業化生產目標產品。基因工程研究對象都是植物的特定組織和細胞，當這部分組織和細胞離開母體系統后，整個代謝調控網絡發生改變，研究結果只能適用于試驗室以及對技術要求很高的生物工程的工廠化生產，無法用于大面積的野外自然條件下的生產。

在植物內生菌及根際微生物的研究中，土壤環境含有的微生物群落增加了背景噪音，選擇無土栽培方式來消除土壤菌群的影響無疑是個好辦法。無 土 栽 培（Soilless Culture，Hydroponics，Solution Culture）是指不用天然土壤，而用營養液或固體基質加營養液栽培作物的方法[48]。

1859-1865年期間，德國科學家薩奇斯（Sachs）和克諾普（Knop）進行植物礦質營養的生理研究，為無土栽培技術研究揭開了序幕。無土栽培先后經歷了無土栽培的試驗研究階段[49,50]、生產的起步階段[51]，真正發展階段開始于1970 年丹麥 Groden公司開發的巖棉栽培技術和 1973 年英國溫室作為研究所的 NFT 技術[52]。20 世紀 70年代以后，隨著營養液膜技術和巖棉栽培技術的發展，世界上商業性的蔬菜和花卉無土栽培逐漸深入到生產中。進入 20世紀 80 年代以后，科學技術的快速發展推動了無土栽培生產的擴大，無土栽培生產亦進入了一個迅速發展階段。

無土栽培最廣泛的應用是在蔬菜栽培生產中，在過去幾十年的全世界蔬菜生產過程中，因具有無公害生產的環境優勢[54-56]，而越來越受歡迎[53]。蔬菜的無土栽培過程中，與傳統土壤栽培條件下相似的植物根部病害依然困擾著生產者，進行營養液和栽培槽消毒雖然可以解決這個問題，但是這一方法成本很高，不但破壞了植物根系的有害微生物，也破壞了植物根系周圍的有益微生物群落。最近，研究者將更多的興趣都集中于各種微生物在無土栽培中的作用[57]。有報道顯示，在無土栽培體系中利用有益微生物進行生態防治的效果好于在傳統的土壤栽培環境中的有益微生物生態防治。因此，推斷在無土栽培的環境系統中有益微生物的菌群比在傳統土壤環境中更容易建立。

4 組學技術和新一代測序技術的應用

4.1 組學技術的應用

組學技術（Omics Technology）是隨著系統生物學（Systems Biology）新學科的產生和發展應運而生的，主要包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學技術等，系統生物學及組學技術是近20年來生物學研究發展最為迅速的領域。基因組學（Genomics）是研究生物基因組的組成，組內各基因的精確結構、相互關系及表達調控的科學；蛋白質組學（Proteomics）是指對“一種基因組所表達的全套蛋白質”，包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質進行研究的科學；代謝組學（Metabolomics）則是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關系的研究方式，是系統生物學的組成部分。

轉錄組（Transcriptome）的概念由 Velculescu VE.等首先提出。轉錄組是指特定細胞在某一功能狀態下全部表達的基因總和，代表了每一個基因的身份和表達水平。同一細胞在不同的生長時期及生長環境下，基因表達情況是不完全相同的，具有特定的空間性和時間性特征[58]。與基因組具有靜態實體的特點不同，轉錄組是受外源和內源因子調控的。因此，它是物種基因組和外部物理特征的動態聯系，是反映生物個體在特定器官、組織或某一特定發育、生理階段細胞中所有基因表達水平的數據。可用來比較不同組織或生理狀況下基因表達水平差異，發現與特定生理功能相關的基因，推測未知基因。

由于組學技術能夠一次從整體上觀察分析得到大量的指標變化，已經成為基因功能和生物標志物的研究中的主要研究手段。不同組學技術之間的交叉使用和數據關聯、組學技術和傳統的分子生物學手段有機結合都將是未來轉化各領域研究的重要手段。

4.2 轉錄組學技術在藥用植物次生代謝研究中的應用

藥用植物和藥用植物提取物及其衍生物是臨床用藥的主要來源。以提高藥用植物次生代謝產物，而對藥用植物次生代謝網絡及其調控的研究，一直是藥用植物應用領域的研究中心。采用單個基因點的研究方式，無法全面闡述次生代謝途徑和構建代謝調控網絡[59，60]。各種組學的研究為藥用植物次生代謝調控網絡的研究提供了可能，其中轉錄組學從基因轉錄水平反映了基因的表達情況，為藥用植物次生代謝途徑中關鍵基因的篩選和功能的研究提供了技術支持。

如今，轉錄組學研究已經在藥用植物中得到了廣泛的應用，已經成為發現新基因與關鍵基因克隆及功能驗證的重要手段之一。在西洋參中利用轉錄組學技術挖掘出24條可能參與人參皂苷生物合成相關酶的基因，通過功能驗證鑒定出了甲羥戊酸（Mevalonic Acid，MVA）代謝途徑中的關鍵酶——3-甲基-3-羥基戊二酰輔酶A還原酶（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase，HMGR）基因，明確了西洋參中人參皂苷的生物合成途徑[61-62]。由于藥用植物沒有基因組測序背景作參考，采用測序長度較長的454/Roche GS FLX測序技術，對于基因的拼接結果更為可靠，利用該技術對西洋參的根進行了高通量轉錄組測序，發現了可能參與不同類型人參皂苷生物合成過程相關的150條細胞色素P450和235條糖基轉移酶候選序列[63]；同樣使用該技術對丹參的2年生根部進行轉錄組高通量測序，獲得1.8萬余個unigene。通過unigene注釋和功能分類，其中27個unigene可能參來自于參酮合成的代謝途徑，29個unigene可能來自于丹酚酸合成的代謝途徑，70個unigene可能來自于CYP450過程，還有轉錄因子序列577條[64]；對烏拉爾甘草的454/ Roche GS FLX高通量轉錄組測序，共獲得2.7萬多個unigene，發現了屬于甘草甜素生物合成途徑中的16個酶的基因，從而初步建立了甘草甜素生物合成途徑[65]。利用分子生物學技術實現藥用植物次生代謝途徑中關鍵酶基因的克隆與體外高效表達，進行次生代謝生物工程化生產，大規模的生產藥用植物的生物活性成分是未來發展方向。

4.3 新一代測序技術在組學中的應用

隨著生命科學進入后基因組時代，功能基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、系統基因組學等組學研究越來越引起人們的重視，相應的對測序技術要求也越來越高，傳統測序方法在測序深度和廣度等方面已經無法滿足大規模基因組測序的需求。研究者已經到認識到快速、低成本測序技術對生命科學發展的重要性。在此背景下新一代高通量測序（Next-Generation Genome Sequencing,NGS）技術應運而生，其中最具代表性的技術平臺有454/Roche GS FLX、Illumina基因組分析儀Ⅱ系統及應用系統生物公司的SOLiD測序技術。

NGS技術具有速度快、成本低、測序度深、產出量大等特點，使其在生命科學研究領域迅速得到廣泛應用。在植物分子生物學研究領域，NGS技術的出現使基因組測序、轉錄組測序、lncRNA測序、microRNAs 測序等不再是難題，有力地支持和推動了植物分子生物學的研究。同時，NGS技術在非模式植物全基因組測序工作中也起到了極大的推動作用，新物種全基因組測序的信息不斷被公布，使科研工作者擺脫了對非模式植物研究缺乏遺傳背景的束縛。2002年的植物全基因組測序完成量是3例，2010年的植物全基因組測序完成量是32例，僅在2010年就有蘋果、黃瓜和玉米的大型基因組得以測序完成[66-68]，相隔8年，完成量增加了9倍多，平均一年有4個植物的基因組被測序完成。2011年，可可、橡膠樹、野草莓、麻風樹等多種植物基因組測序完成[69-72]。

轉錄水平的調控是生物體最主要的調控方式之一，對轉錄水平的研究已從基因芯片技術步移到建立于高通量測序基礎上的轉錄組研究。對同一樣品的深度測序即使是低表達量的基因也可以被捕捉到，而對不同樣品進行同時測序可以獲得樣品之間的差異表達基因。對有參考基因組的轉錄組進行研究還可以獲得轉錄本的表達豐度，轉錄發生位點，可變剪切，轉錄本SNP等重要生物學信息[73]。如對紅花種子、葉片和花使用Illumina的Solexa測序技術進行轉錄組測序和數據的生物信息學分析，獲得了紅花這3個部位的差異表達基因[74]。

轉錄組學研究的一個重要方面就是發現和分析ncRNA。早期研究認為非編碼RNA（ncRNA）是沒有功能的基因，只有少數的ncRNA分子可作為生物遺傳信息從DNA傳向蛋白質過程中的中間過渡產物，其功能是協助RNA轉錄與蛋白質翻譯[75]。近年來，隨著相關技術的發展進步，研究發現基因組中約有50%的DNA轉錄為RNA，僅有約2%的RNA參與蛋白質的翻譯，剩余的98%均不參與[76]。ncRNA 按其功能可分為看家ncRNA和調節ncRNA。前者通常穩定表達，發揮著一系列對細胞存活至關重要的功能，主要包括轉移 RNA（tRNA）、核糖體 RNA（rRNA）、小核RNA（snRNA）及小核仁 RNA（snoRNA）等；后者主要包括長鏈ncRNA（lncRNA）和以microRNA為代表的小ncRNA（small ncRNA），在表觀遺傳、轉錄及轉錄后等多個層面調控基因表達[77]。

過去幾年里對ncRNA的研究大部分集中于小ncRNA[78，79]。有研究者對草莓不同發育時期果實的microRNA進行Illumina的Sloexa深度測序。基于microRNA 相似性序列和二級結構預測，從測序數據中獲得164個保守的microRNA和37個新的microRNA。通過RT-PCR技術對37個新的microRNA進行驗證，來進一步預測新的microRNA的潛在靶基因，對其進行功能注釋分析發現，這些microRNA可能編碼SNARE蛋白、PLAC8家族蛋白、RNA結合蛋白、NAC轉錄因子等功能蛋白。這些microRNA具有較高的測序頻次，表明它們在草莓的果實中有很高的表達量，這說明它們參與了草莓果實的生長發育[80]。lncRNA 由于序列保守性較低曾經一度被認為是轉錄噪音，隨著研究的不斷深入直到近幾年才證明，lncRNA 具有明確的生物學功能[81，82]。目前對 lncRNA 的認識尚處于初級階段，一般認為大于200 nt且缺乏蛋白編碼能力的轉錄本為lncRNA，迄今發現的lncRNA長度從幾百nt到十幾nt不等，大概可以分為正義的、反義的、內含子型的及基因間的[83]。lncRNA可以通過不同模式發揮多種分子功能，如調節轉錄模式，調節蛋白質活力，具有結構和組織功能，改變RNA加工方式和作為一些小RNA的前體[84]。

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Research Progress on the Secondary Metabolism in Astragalus

Zhang Kaixue,Liu Zhenpeng,Yan Song,Ren Weichao,Liu Xiubo,Ma Wei
(College of Pharmaceutical Sciences,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Belonging to leguminous plants,Astragalus contained a variety of biological active ingredients with different pharmacological effects. However,endophytic fungi of astragalus were seldom reported,it was a preliminary research in this study. The plant secondary metabolism network was complex,referring to using specific metabolic pathways of plant secondary metabolites production to improve yield through elicitors,and regulation of biosynthetic pathways. Elicitor included biological elicitor and abiotic inducer. So far,there has only been a preliminary hypothesis over the mechanism of the inducer,lacking of related guidances. The process of screening was slapdash. For eliminating the ambient noise in the test,soilless cultivation in the research of endophytic fungi and rhizosphere microorganisms was utilized,all at once,to eliminate the impact of soil bacteria.With the emergence of new courses and technologies,omics technologies and updating sequencing technology were produced and widely applied in various fields.

Astragalus,secondary metabolism,elicitor,soilless cultivation,omics technologies,updating omics technology

10.11842/wst.2016.05.025

R282.2

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-06

修回日期：2016-11-16

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81274010）：黃芪三萜皂苷類生物合成分子機制調控的研究，負責人：馬偉；黑龍江省科技廳杰出青年基金項目（JC201101）：黃芪SQS基因的克隆、亞細胞定位和功能研究，負責人：馬偉；黑龍江中醫藥大學“優秀創新人才支持計劃”（2012001）：黃芪SQS基因的克隆、亞細胞定位和功能研究，負責人：馬偉；哈爾濱市科技廳優秀學科帶頭人基金項目（2014RFXXJ122）：誘導調控黃芪次生代謝有效成分途徑及轉錄組學研究，負責人：馬偉。

＊＊ 通訊作者：馬偉，研究員，主要研究方向：藥用植物生物工程。