中藥有效性評價與藥效物質基礎發現＊

張愛華，孫 暉，閆廣利，王喜軍

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

中藥有效性評價與藥效物質基礎發現＊

張愛華，孫 暉，閆廣利，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

中藥有效性是中醫藥治療優勢的根本體現，而有效性的科學闡釋是溝通中醫學與現代醫學科學的渠道，中藥有效性評價是發現藥效物質基礎的前提。因此急需建立一種生物學語言，把中藥的有效性科學地表達出來，讓現代生命科學領域認識和接受中醫理論及臨床實踐的科學價值。證候和方劑是中醫學的兩個關鍵科學問題，直接關系到疾病的診斷和臨床療效的有效性。由此，本課題組以證候生物標記物發現為切入點，以方劑為研究對象，建立闡釋中藥有效性的理論及研究方法——中醫方證代謝組學（Chinmedomics），為中藥有效性評價提供了有效途徑。利用中醫方證代謝組學研究方法，揭示臨床常見中醫證候的生物標記物及其相關方劑的有效性，推動了證候的精準診斷及臨床治療經驗的挖掘，為提升中醫理論及臨床實踐的科學價值的認識提供了科學依據。

中醫方證代謝組學 中藥血清藥物化學 有效性評價 藥效物質基礎 生物標記物

健康模式及疾病譜的變化給現代醫學研究提出眾多新的命題，單靶點單一藥物的簡單治療模式難以解決多靶點復雜性疾病的治療問題，個體化的精準診斷及治療又對現代醫學提出了新的挑戰。中醫學方劑配伍的協同增效聯合干預措施，以及中醫學辨證論治個體化治療的精準潛力等在解決多靶點復雜性疾病治療問題方面積累了大量有價值的臨床經驗，具有鮮明的特色和優勢[1-3]。而中藥的有效性是中醫治療優勢的根本體現，也是橫在中醫學與現代醫學科學家之間難以逾越的鴻溝，致使中醫學的優勢及其臨床經驗的價值難以被充分接受及發揮更有效的作用。如何建立一種能夠科學闡釋中藥有效性及其機制的生物學語言，是建立起中醫學與現代醫學科學溝通的橋梁，是發揮中醫藥在治療復雜性疾病及個體化精準治療方面優勢的前提。

中藥有效性評價是挖掘和揭示中醫藥治療優勢的前提，而有效性是與證候和方劑兩大中醫學關鍵科學問題直接相關的[4]。然而，中醫證侯的模糊性及方劑的復雜性極大地限制了方劑的有效性評價及藥效物質基礎的確認；現行有效性評價方法難以體現中醫藥治療復雜性疾病的多成分、多環節、多靶點的整合作用特點[5]。由此，揭示證侯生物標記物，建立方劑的藥效生物評價體系，是評價中藥的有效性及發現中藥藥效物質基礎的必然要求[6]，也是目前國際關注的熱點問題。基于上述思考，90年代初本課題組開始進行了一系列相關的理論及方法研究。并率先提出了從口服方劑后的含藥血清中分離鑒定中藥藥效物質基礎的思路和研究設計，建立了中藥血清藥物化學的理論及方法體系，為發現中藥藥效物質基礎，解決中藥有效性及安全性等質量問題提供了方法學支撐[7，8]。然而，限于當時的技術水平，中醫證候生物標記物尚未被有效闡釋，方劑的療效評價體系未能建立，只是單純分析體內成分及其動態，沒能實現將體內成分和臨床有效性相聯系，研究設計存在超越了證候的致命性缺點。因此必須將研究方法與臨床療效評價緊密結合才能發現表達方劑治療效應的物質基礎。正是由于證候缺乏客觀的診斷標準，從而方劑療效難以正確評價，導致血清藥物化學所揭示的方劑體內成分與臨床療效關系難以有效揭示，成為制約中藥血清藥物化學方法有效實踐的關鍵問題。對此，本世紀初本課題組將代謝組學技術引入中醫藥研究[9]，并將研究工作與中醫臨床研究相結合，在中醫證候臨床體征要素研究的基礎上，將中藥血清藥物化學與代謝組學有機整合，利用代謝組學技術揭示證候的生物標記物，利用血清藥物化學方法發現有效狀態下方劑的體內直接作用物質的顯效形式；在治療有效狀態下將內源性證候的生物標記物與外源性方劑顯效成分相關聯，挖掘與證候標記物軌跡變化高度關聯的藥物成分，發現并確定中藥藥效物質基礎及有效性機制，揭示方劑配伍規律及其科學內涵[10]。由此，在大量研究實踐基礎上，形成了闡釋中藥有效性的理論及方法體系——中醫方證代謝組學（Chinmedomics[11]），為中藥有效性的闡明，臨床證候的精準診斷及精準治療，以及基于經方的創新藥物設計提供有效的研究方法[12]，并在多個證候及相關方劑的研究中得以完善，并開展了大量的研究實踐[13]，在解決中藥有效性等科學問題方面取得了系列的創新性成果。

本課題組采用中醫方證代謝組學方法表征了心氣虛證的代謝輪廓及相關生物標記物，揭示了溫心方治療心氣虛證的有效性及其藥效物質基礎[14]。鑒定了心氣虛證17個代謝生物標記物，主要包括3-氧代十六烷酸、7-酮去氧膽酸、3b，7b，12a-三羥基-5b-膽酸、甘油酸1，3-二磷酸、左旋肉堿、尿酸、二十四碳一烯酸、十八酸、羥基犬尿氨酸等，主要涉及脂肪酸代謝、膽汁酸代謝、嘌呤代謝、色氨酸代謝途徑。給予溫心方治療后代謝生物標記物的軌跡變化產生明顯回調趨勢。研究表明，溫心方通過改善脂肪酸代謝、膽汁酸代謝、嘌呤代謝、色氨酸代謝等多個代謝通路，反向調節心氣虛證的生物標記物使代謝輪廓整體回調。后來，本課題組又表征了溫心方治療心氣虛證顯效狀態下的32個血中移行成分[15]，主要包括人參皂苷類、芍藥苷類、沒食子酰基葡萄糖類、原小檗型生物堿類、酚酸及酚苷和不飽和脂肪酸類等原型成分及原小檗型生物堿類去甲基和亞甲基及其葡萄糖醛酸結合產物等代謝產物。通過方劑體內顯效成分與證候生物標記物關聯度方法，分析與生物標記物軌跡變化高度關聯的體內直接作用物質。研究表明，芍藥苷、人參皂苷Rg1、芍藥內酯苷、小檗堿、巴馬亭、表小檗堿為溫心方治療心氣虛證的關鍵藥效物質基礎。

本課題組利用中醫方證代謝組學技術評價開心散防治老年癡呆癥（Alzheimer’s Disease，AD）的整體效應及并鑒定了AD相關的生物標記物及代謝途徑[16]。聚焦發現了與AD發生發展相關的49個血液代謝生物標記物，主要包括環氧二乙糖、丙氨酸、乙基葡糖苷酸、異冬谷酸、4-咪唑啉酮-5-丙酸、碳酰乙醇酰胺膽酸、9（s）-十八碳二烯酸、甘油磷脂酰膽堿等，涉及色氨酸代謝、酪氨酸代謝、脂肪酸代謝等代謝途徑。利用中藥血清藥物化學方法表征了開心散治療AD顯效狀態下的血中移行成分，主要包括人參皂苷（Ra1、Ra2、Rb2）、茯苓新酸、遠志訕酮Ⅲ、西伯利亞遠志咕噸酮、遠志苷類等46個原型成分及1，6，7-三羥基-2，3-二甲氧基訕酮、6，8-二羥基-1，2，3-三甲氧基訕酮、遠志訕酮Ⅱ等20個代謝產物。通過體內顯效成分與代謝生物標記物關聯度分析方法確定與生物標記物軌跡變化高度關聯的體內化學成分，包括人參皂苷 （Ra1、Ra2、Rb1、Rd、Re、Rb2）、去氫土莫酸、土莫酸、16-脫氧茯苓新酸B、25-甲氧基茯苓新酸、三七皂苷R1、丙二酰基人參皂苷Rb1、丙二酰基人參皂苷Rc、乙酸苯酯等原型成分，以及E-3，4，5-三甲氧基肉桂酸“去乙基”、“葡萄糖醛酸化”、“去乙基+葡萄糖醛酸化”的代謝產物，遠志苷 D “去乙基+葡萄糖醛酸化”、1，6，7-三羥基-2，3-二甲氧基訕酮“葡萄糖醛酸化”，遠志訕酮Ⅰ“葡萄糖醛酸化”、“去乙基+葡萄糖醛酸化”，茯苓新酸E、茯苓新酸C “去乙基”，土莫酸“去乙基+葡萄糖醛酸化”，遠志訕酮Ⅱ經“去乙基+葡萄糖醛酸化”等代謝產物，為開心散治療AD的藥效物質基礎。

基于中醫方證代謝組學方法聚焦發現與傷寒傷陰、肝脾不和證相關的原發性痛經發生發展相關的22個尿液生物標記物，包括肌酸酐、N-乙酰-L-丙氨酸、亮氨酸-羥基脯氨酸、尿酸、N-乳酰乙醇胺、4，6-二羥基喹啉、4，8-二羥基喹啉、泛醌-1、d-脫硫生物素、D-精氨酸、異戊酰基葡萄糖苷酸、黃嘌呤核苷酸、丁基嘧啶磷、異戊氨酰 -纈氨酸、磷酰膽堿、17-羥孕酮、鞘氨醇、雌激素葡萄糖苷酸、前列腺素 A1、18-羥基皮質酮、前列腺素E2 甲酯、L-尿膽素；主要涉及淀粉和蔗糖代謝、甾類激素的生物合成、嘌呤代謝、花生四烯酸代謝、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝、磷酸戊糖代謝、鞘脂類代謝、色氨酸代謝等代謝途徑。在治療有效性基礎上，表征了芍藥甘草湯治療原發性痛經的血中移行成分[17]，其中包括13個原型成分，主要是沒食子酸、白芍苷、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、苯甲酸芍藥苷、異甘草素、芒柄花黃素、甘草酸、甘草異黃酮、甘草香豆素、異甘草黃酮醇、甘草利酮，以及2個代謝產物（甘草素-4-O-葡糖苷酸、芒柄花黃素葡糖甘酸）。利用體內顯效成分與生物標記物關聯度方法發現芍藥甘草湯的主要藥效物質基礎是沒食子酸、白芍苷、苯甲酸芍藥苷及甘草酸，其通過調節肌酸酐、N-乙酰-L-丙氨酸、亮氨酸-羥基脯氨酸、尿酸、N-乳酰乙醇胺、4，6-二羥基喹啉等關鍵代謝標記物，影響谷氨酰胺合成酶、磷脂酶A2、卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶，通過解決花生四烯酸代謝、磷酸戊糖代謝、色氨酸代謝、嘌呤代謝障礙，改善原發性痛經。

基于中醫方證代謝組學技術平臺發現與腎陰虛火旺型前列腺炎癥相關的18個血液代謝生物標記物[18]，主要包括牛磺酸、酪胺葡萄糖醛酸、尿酸、2-羥基馬尿酸、抗壞血酸維生素C、L-高苯丙氨酸、馬尿酸、甘氨酸等代謝標記物，涉及酪氨酸代謝、嘌呤代謝、苯丙氨酸代謝、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、丙氨酸、甘氨酸絲氨酸及蘇氨酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯等代謝途徑。鑒定了知柏地黃丸治療腎陰虛火旺型前列腺炎癥顯效狀態下的51個血中移行成分，主要包括小檗堿、巴馬汀、黃柏酮、黃柏內酯、銀杏黃酮、莫諾苷、馬錢苷等35個原型成分及黃柏堿葡萄糖醛酸結合物、四氫巴馬汀葡萄糖醛酸結合物、藥根堿葡萄糖醛酸結合物等16個代謝產物。采用方劑體內顯效成分與生物標記物關聯度分析方法，確定了知柏地黃丸配伍環境下關黃柏治療腎陰虛火旺型前列腺炎癥顯效狀態下的特有藥效物質基礎是黃柏酮、黃柏內酯、木蘭堿、巴馬汀及小檗堿；發現上述成分主要通過調節尿酸、馬尿酸、牛磺酸、甘氨酸等關鍵代謝標記物，通過解決牛磺酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝、酪氨酸代謝及甘油磷脂代謝障礙，抑制了與炎癥相關的氧化應激反應，進而阻止了腎陰虛火旺型前列腺炎癥的發生發展。

本課題組相繼通過腎陽虛證[19]、黃疸證[20]等9個中醫證候代謝生物標記物及金匱腎氣丸、茵陳蒿湯等14個方劑的有效性研究，使中醫方證代謝組學理論和方法得到完善，形成融合了證候/病生物標記物的發現、證候相關動物模型復制、方劑體內顯效成分分析及方劑體內顯效成分與生物標記物關聯度分析等方法與技術的中醫方證代謝組學理論及研究體系，為闡釋中藥藥效物質基礎及有效性優勢提供了有效途徑。目前，“中醫方證代謝組學”被國內外廣泛接受并引用。2015年底，《Nature》（自然）（VOL528，Issue No. 7582）詳細介紹該理論，認為該策略搭建了中醫學與現代醫學科學溝通的語言橋梁，對于深入認識中醫藥的有效性，提升中醫臨床經驗的社會價值，推動中醫藥學術進步及新醫學理論形成具有重要意義。

中醫是復雜的特殊的生命科學，其辨證論治的理論不僅僅體現在個體化精準治療，更重要的是體現在關注證候，而證候是人與病結合的表型，具有高度的復雜性；由此，中醫在臨床實踐中一貫采取聯合干預的治療措施，采取多藥物配伍組成的方劑對應復雜的證候，即方證對應。這種診治疾病的理念和臨床實踐，在解決當前多基因復雜性疾病方面，以及個體化精準治療方面均體現其特有的優勢。而中醫方證代謝組學即是以系統生物學語言闡釋復雜性證候實質及中醫方劑有效性，闡釋中醫藥有效性優勢，從根本上揭示“方劑-體內顯效成分-生物標記物-證候”的對應關系實質，從而挖掘中醫理論及臨床實踐社會價值。

然而，由于證候的復雜性及病證結合狀態的普遍性，使闡釋人與病結合的證候表型及病證結合表型更具有挑戰性；加之，代謝組學本身也存在某些技術層面的問題，使單純的利用代謝組學闡釋其證/病的生物學本質存在一定的局限性。未來必須在代謝標記物的基礎上，關注上游的功能蛋白及基因，從而使證候生物學本質研究更深入更具體，促使治療更精準；如此，也能使方劑的有效性評價及藥效物質基礎的發現更具有臨床價值。在中醫方證代謝組學理論建立之初，本課題組已經考慮到此問題，研究實踐中也在緊緊地與蛋白組學等其它組學相結合。由于代謝組學是該理論的核心技術，所以在該理論的中文名稱上稱為“中醫方證代謝組學”，而英文名稱為“Chinmedomics”[11]，是以組學“omics”進行定義的，也是考慮給該理論留出空間，在未來引入并整合蛋白組學、轉錄組學及基因組學等理論和技術，使該理論不斷在實踐中得以完善。同時，下一步將在各種臨床常見證候患者大樣本方證代謝組學分析，以及病證結合患者大樣本方證代謝組學分析的基礎上，通過大數據整合分析，建立涵蓋常見中醫證候及病癥結合表型的代謝輪廓及生物標記物、代謝輪廓與有效方劑、生物標記物與有效成分的軟件包，實現病證的精準診斷，基于標記物分析的精準治療和藥效物質基礎發現方面進一步創新。

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Evaluating Effectiveness and Discovering Efficacy Substances of Traditional Chinese Medicine

Zhang Aihua,Sun Hui,Yan Guangli,Wang Xijun
(Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center,National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry,Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

The effectiveness of traditional Chinese medicine (TCM) is a fundamental expression of its treatment advantage; and the scientific interpretation of the effectiveness is a communication link connecting Chinese medicine and modern medicine,while evaluating the effectiveness of TCM is a premise for discovering efficacy substances. Thus,it is an urgent need to establish a biological language which was valid enough to scientifically express the effectiveness of TCM,making the modern life science recognize and accept the scientific value of the TCM theory and its clinical practice. Syndromes and formulae (or prescription) are two critical issues of TCM and directly related to the disease diagnosis and the effectiveness of TCM clinical efficacy. For these reasons,our team has taken syndrome biomarkers as the starting point and the effective prescription as the research object,and established the “Chinmedomics strategy” to investigate the efficacy substances and mechanisms behind formulae’s protective effect on syndromes,providing an effective way for evaluating the effectiveness of TCM. Through Chinmedomic techniques,we can reveal the candidate biomarkers of the common clinical syndromes and the effectiveness of related prescriptions,which allows us to promote the accurate diagnosis of syndromes and mine the clinical experiences,and provide scientific evidences for enhancing the value of the theory and the clinical practice of TCM.

Chinmedomics,serum pharmacochemistry of TCM,effectiveness,efficacy substance,biomarkers

10.11842/wst.2016.05.001

285

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-04-10

修回日期：2016-04-10

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81430093）：中藥體內藥效物質基礎的系統分析方法學——中醫方證代謝組學研究，負責人：王喜軍；國家自然科學基金委面上項目（81373930）：基于代謝標記物及代謝經路的生脈散防治老年性癡呆的藥效物質基礎及作用機制研究，負責人：王喜軍；國家自然科學基金委青年基金項目（81302905）：基于藥物代謝組學的開心散防治老年癡呆癥的物質基礎及機制研究，負責人：張愛華；科學技術部“重大新藥創制”國家科技重大專項（2015ZX09101043-005， 2015ZX09101043-011）：中藥經典名方整合作用機制關鍵技術研究，負責人：王喜軍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥血清藥物化學及中醫方證代謝組學研究。