寧腎顆粒對LPS誘導大鼠系膜細胞增殖及凋亡的影響＊

趙 林，李安源，齊芳華，王志學，牟林茂

（山東大學附屬省立醫院 濟南 250021）

寧腎顆粒對LPS誘導大鼠系膜細胞增殖及凋亡的影響＊

趙 林，李安源＊＊，齊芳華，王志學，牟林茂

（山東大學附屬省立醫院 濟南 250021）

目的：本研究旨在探討寧腎顆粒對脂多糖（LPS）誘導大鼠系膜細胞（MCs）增殖及凋亡的影響。方法：采用MTT法、細胞流式技術、Western bolt法檢測不同劑量寧腎顆粒中藥血清對LPS誘導大鼠系膜細胞增殖、凋亡及血小板源生長因子-BB（PDGF-BB）蛋白表達的作用。結果：含藥血清能抑制LPS誘導大鼠MCs增殖、促進MCs凋亡，下調PDGF-BB蛋白的過度表達。結論：寧腎顆粒可抑制LPS誘導的MCs異常增殖、促進MCs凋亡，其分子機制可能與抑制PDGF-BB蛋白的過度表達有關。

寧腎顆粒 系膜細胞 增殖 凋亡 血小板源生長因子-BB

腎小球系膜細胞（Mesangial cells，MCs）異常增殖是多種腎小球疾病的基本病理改變。MCs異常增殖可引起細胞外基質的過量生成和聚集，參與腎小球炎癥的發展，最終可導致腎小球硬化、腎臟纖維化及終末期腎功能衰竭；抑制MCs異常增殖在延緩慢性腎臟疾病進展的過程中起到重要作用[1]。寧腎顆粒在治療難治性腎病綜合征取得了較好的臨床療效[2]，但其作用機制尚不明確。本研究旨在通過體外實驗，觀察寧腎顆粒對脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導增殖的大鼠MCs異常增殖及凋亡的影響，探討寧腎顆粒治療難治性腎病綜合征的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

杜爾伯科改良伊格爾（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）培養基系美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）和二甲基亞砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）系美國Sigma公司生產；PDGFBB（ab16829） 、GAPDH（ab9485） 多克隆抗體由英國Abcam公司生產；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗由北京中杉公司生產。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀FACSCan均由美國BD公司產。計算機凝膠成像分析系統Alphaimager 2200型（美國Pharmacia Biotech公司），酶標儀Spectra Max M2型（美國Molecular Devices公司），蛋白垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），電轉膜設備（美國Bio-Rad公司），EC250-90恒流/恒壓電泳儀（英國Hybaid，IEC儀器公司 ），低溫高速臺式離心機IEC Micranax RF型（德國Beckman公司）。

1.2 藥物

寧腎顆粒的組成是仙茅、生地黃、黃芪、仙靈脾、金櫻子、覆盆子、白花蛇舌草、萆薢、益母草（藥物應用三九免煎中藥顆粒，批號：20081016）。

1.3 含藥血清的制備

實驗含藥血清的制備采用清潔級雄性Wister大鼠，體質量180-220 g，購自山東大學實驗動物中心。將20只大鼠隨機分為3組。正常血清組（10只），灌服0.9%氯化鈉注射液；含藥低劑量血清組（5只），每日灌服寧腎顆粒12 g·kg-1；含藥高劑量血清組（5只），每日灌服寧腎顆粒24 g·kg-1。每日灌藥2次，灌胃3日；第4日，2次服藥時間間隔2 h；采血在末次給藥后2 h后，采血前禁食12 h。采血后分離血清，56℃滅活30 min，-20℃保存，備用。

1.4 細胞培養

大鼠系膜細胞株（HBZY-1）購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。MCs常規培養于含有10%小牛血清的DMEM完全培養液（含100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，3 mmol·L-1L-谷氨酰氨）中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每2-3 日換培養液。在系膜細胞生長貼壁約80%時，經緩沖液沖洗2次，25 mg·L-1胰蛋白酶消化細胞后，懸浮細胞，常規傳代。實驗選用第4-5代傳代對數生長期細胞。

1.5 細胞毒性試驗

按照每孔總體積200 μL、細胞數4×103個的標準，接種MCs于96孔板。置37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，換成無血清DMEM培養液進行同步化培養24 h后，分4組換液。正常對照組（Con組）：正常大鼠血清。LPS組：正常大鼠血清+LPS（10 μg·mL-1）。含藥低劑量組（NSL組）：含藥低劑量血清+LPS（10 μg·mL-1）。含藥高劑量組（NSH組）：含藥高劑量血清+LPS（10 μg·mL-1）。每孔200 μL，每組設5個復孔，繼續培養48 h后，棄上清。用25 mg·L 1的胰蛋白酶消化細胞，取待測細胞懸液0.1 mL 加D-Hanks液0.8 mL及0.3%臺盼蘭0.1 mL，混懸后滴入血球計數板中，相差顯微鏡下計數細胞數，死細胞著色而活細胞不著色，計算活細胞比率（活細胞比率=活細胞數/總細胞數×100%）[2]。

1.6 MTT法檢測MCs增殖情況

將MCs種于96孔板中，4×103細胞/孔，總體積200 μL，含有10%小牛血清的DMEM完全培養液中培養24 h，同步化24 h后分組，分組及干預方式同“細胞毒性試驗”。每組設5個復孔，繼續培養48 h。分別于培養結束前2 h加入MTT（四甲基偶氮唑藍）20 μL/孔（5 mg·mL-1），繼續37℃、5%CO2培養箱中培養2 h，棄上清后加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，酶標儀波長設定為570 nm，檢測OD570。實驗重復3次，均納入統計。

1.7 流式細胞術檢測MCs細胞凋亡率

將MCs種于培養皿中，5×104細胞/皿。24 h后鏡下觀察細胞生長良好，部分融合，換成無血清DMEM培養液以同步化。將同步化24 h后的細胞，分為4組（分組及干預方式同上），每組設3個復孔，培養48 h后。將細胞懸浮后收集到離心管中，1 000 r·min-1離心5 min。用PBS重懸浮，并按1:10比例加入細胞裂解液，室溫輕振蕩后，1 000 r·min-1離心5 min。去上清，用PBS打散細胞，加入500 μL Annexin V染色緩沖液重懸細胞，加入4 μL Annexin V FITC、4 uL PI，混勻。避光，室溫反應10 min。上流式細胞儀分析。實驗重復3次，均納入統計。

1.8 Western bolt檢測PDGF-BB蛋白表達

按照細胞數4×105個/孔的標準，接種MCs于6孔板中，分組及培養方法同“細胞毒性試驗”中所述。每組設2個復孔。含藥血清干預48 h后，收集各組細胞，加裂解液并超聲碎裂后提取細胞總蛋白。按照BCA試劑盒說明書步驟，配置BCA工作液，設定標準空及樣品孔并加樣，37℃反應30 min，應用酶標儀檢測 ，波長調至562 nm測得吸光度，擬合標準曲線，根據標準曲線計算樣品蛋白濃度。每樣本取總蛋白20 μg，加等量樣本處理液，煮沸10 min，在SDS-PAGE膠上樣 ，常規電泳、轉膜，血小板源性生長 因 子-BB（Platelet-Derived Growth Factor-BB，PDGF-BB）、GAPDH分別為一抗，濃度為1:2000，4℃下反應，過夜。次日，洗膜3次后加入二抗，室溫下反應2 h，洗膜3次。于暗室進行顯色、曝光成像。利用圖像分析系統掃描、分析膠片上條帶的相對吸光度值（內參GAPDH的蛋白印記條帶的吸光度值為相對值1）。實驗重復3次，均納入統計。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 細胞毒性試驗

干預48h后，含藥血清對細胞活力無影響，各組活細胞比率均在95%以上。

2.2 寧腎顆粒對LPS誘導MCs增殖的影響

與Con組（對照組）比較，干預48 h后，LPS組MCs增殖率明顯提高（ P＜0.01）。與LPS組對比，NSL和NSH組MCs增殖率均明顯降低（P＜0.01），且與NSL組比較，NSH組MCs增殖進一步受到抑制。（P＜0.01）如圖1所示。

圖1 干預48 h后MTT法檢測各組OD值比較

2.3 寧腎顆粒對MCs凋亡率的影響

干預48 h后，與Con組相比，LPS組凋亡率明顯降低（P＜0.01）。與LPS組比較，NSH組凋亡率明顯提高（P＜0.05 ），而NSL組凋亡率無明顯差異。如圖2 所示。

圖2 干預48 h后各組凋亡率比較

2.4 寧腎顆粒對PDGF-BB蛋白表達的影響

干預48 h后，與Con組比較，LPS組PDGF-BB蛋白上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）。NSH組PDGF-BB蛋白表達較LPS組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01），而NSL組較LPS組無顯著差異。且NSH組PDGF-BB蛋白表較NSL組明顯降低（P＜0.05）。如圖3所示。

圖3 干預48 h后各組PDGF-BB蛋白表達相對灰度

3 討論

難治性腎病綜合征是一種小兒常見病，在我國患病率亦呈快速增長趨勢[3]，常纏綿不愈，臨床治療棘手。本病可歸入中醫學“水腫”、“虛勞”的范疇。本課題組認為本虛標實是難治性腎病綜合征的病機關鍵，以脾腎虧虛為本、濕熱邪毒熾盛為標。故以“健脾益腎、清熱利濕”為治則擬定寧腎顆粒。方中君藥黃芪、仙茅、仙靈脾，功在溫補脾腎；臣藥白花蛇舌草、萆薢、益母草、生地，功在清熱解毒、利水消腫；金櫻子、覆盆子益腎固精是為佐藥。全方攻補兼施、寒溫并用，共奏健脾益腎、清熱利濕之功。寧腎顆粒在臨床上治療難治性腎病綜合征已取得一定療效[4]。

MCs是腎小球內非常活躍的固有細胞，在生理狀態下不發生明顯的增殖活動，而在病理狀態下，MCs過度增殖并分泌大量的細胞外基質及炎癥因子，導致腎小球硬化，造成腎臟功能進行性損害[5-7]。因而有效地抑制MCs的增殖將會在很大程度上減緩慢性腎炎、腎小球硬化的進展[8]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分，可以引起免疫刺激的級聯反應和機體的毒性病理生理活動，促進細胞因子的釋放，是誘導MCs異常增殖的常用刺激物。在本實驗中，應用LPS干預MCs后，MCs較正常對照組確有明顯增殖。寧腎顆粒含藥血清干預后，LPS誘導的大鼠MCs異常增殖得到有效抑制，且抑制率隨藥物劑量增加進一步提高。

細胞凋亡是機體是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式。細胞凋亡能清除體內不需要的或有害的細胞，控制細胞數量，是維持自身穩定狀態的一個重要機制。近年來，有研究資料顯示MCs凋亡也是防止MCs過度增殖的重要機制，是腎小球增生性疾病進展得以控制或消除的方式之一[9，10]。本實驗結果表明，高劑量的寧腎顆粒能顯著提高MCs的凋亡率。

PDGF是目前已知多肽生長因子中最強的有絲分裂原之一，具有多生物學效應、參與多組織器官生理活動與病理損傷過程的重要細胞因子，其過度表達可導致多種疾病的產生。目前已知的PDGF家族成員，包括PDGF-A、B、C、D，它們都含有一個高度保守的PDGF/血管內皮生長因子同源結構域，通過二硫鍵連接形成同型或異型二聚體，其中PDGF-BB參與了多種腎病發生發展的病理過程[11-12]。它可以促進MCs增殖，并且還參與系膜細胞收縮、趨化、分泌細胞外基質以及分泌其他細胞因子的病理過程，從而可以進一步誘導腎臟損害[13-16]。有效抑制PDGF的過度表達、阻斷其對MCs的異常刺激作用是有效防治腎病發展的重要環節[17，18]。本實驗結果表明，大劑量的寧腎顆粒可以抑制PDGF的過度表達，這可能是寧腎顆粒能抑制MCs異常增殖的分子機制之一。

綜上，寧腎顆粒可以抑制LPS誘導的大鼠MCs增殖、促進MCs凋亡，這可能與其抑制PDGF的過度表達有關。

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Effects of Ningshen Granule on the Proliferation and Apoptosis of Rats’ Glomerular Mesangial Cells Induced by LPS

Zhao lin,Li Anyuan,Qi Fanghua,Wang Zhixue,Mu Linmao
(Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250021,China)

This study aimed to evaluate the effects of Ningshen granule on the proliferation and apoptosis of glomerular mesangial cells (MCs) induced by lipopolysaccharide (LPS),and the expression of platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB). The drug-contained serum of model rats were prepared and used for intervention of LPS-stimulated glomerular MCs. The proliferation of LPS-stimulated MCs was measured by the MTT assay. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry,while the expression of PDGF-BB protein was semi-quantified by western bolt. It was found that the proliferation of MCs was inhibited by the Ningshen granule-contained serum,while the apoptosis of LPS-stimulated MCs. Besides,the overexpression of PDGF-BB was reversed. It was concluded that Ningshen granule inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of LPS-stimulated MCs of rats,which may connect with the inhibition of overexpression of PDGF-BB.

Ningshen granule,nephropathy,glomerular mesangial cells,apoptosis,PDGF-BB

10.11842/wst.2016.05.023

R2-03

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-02-17

修回日期：2016-03-29

＊ 山東省中醫藥管理局中醫藥科技發展計劃課題（2007-124）：寧腎顆粒對IgA腎病系膜細胞凋亡的影響及其機制，負責人：李安源。

＊＊ 通訊作者：李安源，主任醫師，博士生導師，主要研究方向：小兒疾病的中西醫結合臨床與實驗研究。