Box-Behnken設計優化美洲大蠊中游離氨基酸提取工藝＊

鄒俊波，熊永愛，桑文濤，楊勝群

（成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室/四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地 成都 611137）

Box-Behnken設計優化美洲大蠊中游離氨基酸提取工藝＊

鄒俊波＊＊，熊永愛，桑文濤，楊勝群

（成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室/四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地 成都 611137）

目的：采用響應面法優化美洲大蠊中氨基酸的提取工藝參數。方法：在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken中心組合設計，以氨基酸含量、干膏率為評價指標，對提取時間、料液比、醇提濃度、提取次數等4個主要影響因素進行考察，并進行工藝優化。結果：通過Box-Behnken效應面法及總評歸一值（Optical Density，OD）系統評價，確定最優提取工藝如下：取飲片適量，加入12倍量70%乙醇溶液，提取2次，每次120 min。利用該工藝條件得到的氨基酸含量及干膏率與理論預測值基本一致。結論：實驗確立的響應面模型與實際情況擬合良好，能較好的預測美洲大蠊中氨基酸含量及干膏率等指標，該方法具有一定的實用價值。

游離氨基酸 Box-Behnken設計 總評歸一值 美洲大蠊

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）屬于昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科，在地球上有3億多年的生存歷史，有“活化石”之稱，是至今為止繁衍最成功的昆蟲類群之一[1]。美洲大蠊的藥用記載最早見于《神農本草經》，目前以其為原料已開發出數種中成藥，如心脈隆注射液、康復新液、肝龍膠囊和消癥益肝片等，在國內取得了較大的經濟效益。

回流提取方法為工業最常見的提取方法之一，具有提取效率高，節約溶媒等優點。響應面法通過對等高線及響應曲面的客觀分析尋求最佳參數，采用多元二次回歸方程擬合響應值與因素之間函數關系的一種優化統計方法。目前，該法已在很多領域如化學、生物學、醫藥學等得到廣泛應用。本研究采用Box-Behnken響應面法設計優選提取工藝，考察溶媒量、溶媒濃度、提取時間以及提取次數等對氨基酸含量和干膏率的影響，確定最佳提取方案，以期為美洲大蠊相關制劑的工業化提取提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE52CS型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），BT25S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司），MODEL型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），B-220型電熱恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）， Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），色譜柱為Agilent XDB C-18（4.6×250 mm，5 μm）。

1.2 藥材及對照品

美洲大蠊飲片購于成都荷花池中藥材市場，經成都中醫藥大學馬逾英教授鑒定為蜚蠊科大蠊屬昆蟲美洲大蠊Periplaneta americana L.；甘氨酸（批號：140622-1）、脯氨酸（批號：140721-7）、丙氨酸（批號：141109-6）、纈氨酸（批號：141214-5）、亮氨酸對照品（批號：142221-7）均購于成都曼思特生物科技有限公司。

表1 氨基酸分析系統二元梯度程序

1.3 試劑

乙腈（色譜純，美國Tedia公司），其他試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 實驗方法

2.1 游離氨基酸提取工藝

揀選、粉碎美洲大蠊飲片，加10倍量（V）的85%乙醇溶液連續回流提取2次，每次2 h，減壓回收乙醇，濃縮收膏，再加入20倍量（V）的純化水，混合、攪拌充分，靜置待藥液分層，過濾，收集濾液，減壓濃縮，即得。

2.2 氨基酸含量測定[2-6]

2.2.1 對照品溶液儲備液制備

精密稱取纈氨酸（Valine，VAL）、脯氨酸（Proline，PRO）、甘氨酸（Glycine，GLY）、丙氨酸（Alanine，ALA）、亮氨酸（Leucine，LEU）對照品適量，用硼酸緩沖溶液（pH=9.0）制成每1 mL含上述對照品分別為8、8、10、15、8 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液儲備液制備

取“2.1”項下濃縮液2.0 mL，轉移至25 mL量瓶中，加硼酸緩沖溶液（pH=9.0）稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 游離氨基酸對照品、樣品溶液、空白溶液的HPLC色譜圖注：A.游離氨基酸對照品，B.樣品溶液，C.空白溶液色譜圖。

2.2.3 對照品、供試品溶液制備

取“2.2.1”及“2.2.2”項下溶液各5.0 mL，轉移至10 mL棕色量瓶中，加入2,4-二硝基氟苯溶液2.0 mL，搖勻，封口，放在60℃水浴中，避光暗反應60 min。待反應完成后，冷卻至室溫，用磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）稀釋至刻度，混勻，濾過，續濾液即為對照品溶液、供試品溶液，待測。

2.2.4 色譜條件

大連依利特Elite-AAK 氨基酸專用柱（4.6×250 mm，5 μm），流動相A：0.05 mol·L-1醋酸鈉緩沖溶液，含1%（V）N，N-二甲基甲酰胺，pH=6.8；流動相B：乙腈-水（1:1）；流速：1.2 mL·min-1。檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。流動相洗脫梯度見表1。

此條件下，各對照品分離度及對稱性較好，如圖1所示。

2.2.5 線性關系考察

按“2.2.4”項下色譜條件，取游離氨基酸對照品溶液2、4、6、8、10、20 μL注入高效液相色譜儀。分別以各游離氨基酸峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸，各成分回歸系數分別為0.999 2、0.999 6、0.999 7、0.999 1、0.999 9，結果表明：各游離氨基酸在相應線性范圍內與峰面積線性關系良好。

2.2.6 精密度

精密吸取氨基酸對照品溶液，連續進樣6次，各游離氨基酸峰面積的RSD分別為1.83%、2.03%、1.19%、1.91%、2.01%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性

取供試品溶液，分別于0、1、2、4、24 h測定氨基酸含量，各成分峰面積RSD分別為1.69%、1.93%、1.97%、1.08%、1.83%，表明在方法穩定性良好。

2.2.8 重復性

分別制備供試品溶液6份，連續進樣，得氨基酸平均含量的RSD分別為2.52%、1.89%、2.33%、2.07%、1.99%。表明該方法重復性良好。

2.2.9 準確性

精密量取9份已知含量的氨基酸濃縮液1.0 mL，按所含氨基酸含量的80%、100%、120%分別加入各氨基酸對照品儲備液適量，平行制備3份，供試品溶液，測定，計算回收率，平均回收率分別為96.42%、94.83%、95.02%、96.99%、97.78%，RSD分別為2.92%、2.69%、3.89%、3.63%、3.46%，表明該方法準確性良好。

2.3 干膏率

精密量取氨基酸濃縮液適量，置恒重蒸發皿中，按《中國藥典》2015 年版一部附錄IXG干燥失重測定法測定，計算干膏率。

3 結果

3.1 單因素實驗

3.1.1 提取時間對氨基酸含量的影響

精密稱取美洲大蠊飲片100 g，固定料液比、醇提濃度和提取次數，考察不同提取時間30、60、90、120、150 min對氨基酸含量的影響。從圖2A可知，氨基酸含量隨提取時間的延長而逐漸升高，在90 min后趨于平穩。因此，在進一步通過Box-Behnken優化最佳提取工藝時，應在90 min的兩端參數進行篩選，即選擇60、90、120 min進行綜合考察。

3.1.2 料液比對氨基酸含量的影響

準確稱取美洲大蠊飲片100 g，固定提取時間、醇提濃度和提取次數，考察不同料液比1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16對氨基酸含量的影響。圖2B表明，氨基酸含量隨著料液比的增加而不斷增加，當溶媒量超過10倍后，含量增加逐漸趨于平緩，在后續Box-Behnken設計中，溶媒量的考察范圍應為10-14倍。

3.1.3 醇提濃度對氨基酸含量的影響

準確稱取美洲大蠊飲片100 g，固定提取時間、料液比和提取次數，考察不同醇提濃度50%、60%、70%、80%、90%對氨基酸含量的影響。圖2C表明，隨著提取用醇提濃度的增加，氨基酸總量亦即增加，但在超過70%濃度后，游離氨基酸的含量開始下降，故在后續Box-Behnken優化時，考察范圍設定為60%-80%。

3.1.4 提取次數對氨基酸含量的影響

準確稱取美洲大蠊飲片100 g，固定提取時間、料液比和醇提濃度，考察不同提取次數1、2、3、4次對氨基酸含量的影響。從圖2D可看出，提取次數的增加，氨基酸總含量也增加，但2次時已基本可提取完全，從提取效果和大生產效益角度綜合考慮，最佳提取次數定為2次。

3.2 Box-Behnken效應面法優化試驗

3.2.1 模型建立及顯著性檢驗

單因素實驗表明，提取2次能基本將氨基酸提取完全，因此，將提取次數定為2次，后續效應面實驗不再對提取次數進行考察。實驗擬選取提取時間（X1）、料液比（X2）和醇提濃度（X3）等作為影響因素，以氨基酸含量和干膏率“總評歸一值”（OD）Y為評價指標，根據Hassan公式對各個指標進行均一化處理[2-6]。

計算公式:di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）

其中，Yi為實測值，Ymin和Yma系指每一指標在不同次實驗中測得的所有值中的最小和最大值。

計算出各指標的di值后，OD = (d1×d2…×d k)1/k，k為指標數。實驗設計和結果見表2、表3。

圖2 美洲大蠊游離氨基酸提取的單因素實驗結果

表2 氨基酸提取工藝Box-Behnke n實驗設計的因素水平表

以歸一值OD為因變量，通過Design Expert V8.0.5b 軟件對各因素進行回歸擬合，得到氨基酸含量和干膏率歸一值（Y）對提取時間（X1）、料液比（X2）和醇提濃度（X3）的二項多次回歸模型方程為

Y=0.80+0.10X1+0.031X2-0.076X3+0.07X1X2-0.13X1X3-2.5E-003X2X3+0.053X12-0.13X22-0.50X32

（R2=0.9607，R-Squared =0.882 2，P＜0.01，失擬度＞0.05）。

由擬合方程的相關系數R可以得知多元二項式擬合方程相關系數較高，擬合效果較好，模型方程顯著（P＜0.01），模型失擬度P＞0.05，提示誤差在可接受范圍內，所建模型合理。R2=0.960 7，表明只有3.93%的差異是模型不適解釋的，調整后R2（R2adj）值與預測R2（R2pred）值接近，表明該實驗建立的模型合理可行。

3.2.2 效應面法分析及最優提取條件的確定

回歸模型的響應曲面及等高線見圖3。由圖可知提取時間（X1）和醇提濃度（X3）交互作用顯著，表現為響應曲面較陡，等高線圖呈橢圓形。以OD值對最佳工藝進行預測，結果X1=119.09、X2=12.25、X3=68.93%。考慮到實驗操作的可行性，各因素取整數值，最終確定最佳提取工藝為加入12倍量70%乙醇溶液，提取2次，每次120 min。

表3 美洲大蠊氨基酸提取工藝Box-Behnken實驗結果

3.2.3 模型驗證

使用最優工藝進行3次驗證試驗，分別測定。預測OD值為0.976 6，3次樣品的OD值分別為0.956 5、0.961 3、0.972 5，偏差分別是 2.06%、1.57%、0.42%，實際數據與預測結果比較接近，提示該模型的合理性和準確性，也證明了所選工藝穩定可行。

4 討論

美洲大蠊為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱蟑螂。其藥用歷史可追溯至東漢《神農本草經》，當中所記載的藥名為“蜚蠊”[7]。其與澳洲大蠊、褐色大蠊同為常用的蜚蠊科動物藥，也是目前的藥用研究趨向，相關制劑在臨床上可用于治療消化性潰瘍[8]、燒燙傷、褥瘡[9]、肝炎肝纖維化[10，11]等，藥效良好，具有極高的藥用價值。

美洲大蠊中氨基酸含量較高，種類齊全，氨基酸作為合成各種具有重要功能分子的必需前體物，具有調節免疫、調節代謝等獨特的功能[12]。楊芳等[13]研究表明，美洲大蠊必需氨基酸含量占氨基酸總量的35.75%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值為0.55，與WHO/FAO規定的40%和0.6相接近，配比合理，具有很高的營養價值和保健作用。目前有較多文獻報道了美洲大蠊中氨基酸的提取方法，主要集中于不同提取方式的對比[14，15]，如回流提取、超聲提取、索氏提取以及閃式提取（包括水提取、醇提取等）等方法在氨基酸提取程度上的差異考察，未有相關文獻對目前工業上最常用的回流提取法進行參數優化，本試驗以此為切入點，結合Box-Behnken法在中藥提取工藝中的普遍應用及諸多優點[16-18]，進行美洲大蠊中游離氨基酸提取工藝的Box-Behnken設計優化。

圖3 效應面分析提取時間、料液比、醇提濃度因素與響應值（OD）的等高圖和三維圖

本試驗以美洲大蠊的有效成分氨基酸為指標，對回流提取工藝進行優化，提高了總氨基酸的提取率，相對優于超聲及索氏提取工藝，與文獻報道基本一致[19]，為工藝和后續成型及產品質量控制提供銜接和過程控制作用。在試驗設計中，多指標的處理一般多數采用加權評分的綜合評分法，依據評分高低優選條件，目前權重值的判斷仍存在較大爭議，對結果的客觀性會造成一定的影響。通過引入總評“歸一值”（OD），使所有指標均量化體現，客觀地綜合所有試驗指標，使多指標模型具有更準確的擬合性和預測性。故本實驗引入了總評“歸一值”來考察不同提取工藝對氨基酸含量和干膏率的總評“歸一值”（OD）的影響，以此確定最佳游離氨基酸提取工藝。試驗結果表明該法所擬合的方程穩定可行，所優選的工藝對美洲大蠊的工業化生產具有一定的指導意義。

1 何正春,彭芳,宋麗艷,等.美洲大蠊化學成分及藥理作用研究進展.中國中藥雜志,2007,32(21): 2326-2331.

2 劉澤玉,蘇柘僮,楊明,等. 聯用Plackett-Burman與Box-Behnken設計控制青黛制備過程中靛玉紅的生成. 中國中藥雜志,2010,35(19): 2551-2555.

3 沈秀娟,周倩,孫立立,等. Box-Benhnken設計效應面法優選黃芪切制工藝. 中國中藥雜志,2014,39(13): 2498-2503.

4 徐璐,汪濤,郭巧生,等. 響應面法優化超聲輔助法提取昆侖雪菊色素的工藝研究. 中國中藥雜志,2014,39(24): 4792-4797.

5 王秀海,楊緒芳,范業文,等. 效應面法優化九味熄風顆粒一步制粒工藝. 中國中藥雜志,2014,39(24): 4782-4786.

6 羅素元,郭萍,錢剛,等. 延胡索水提物及左旋延胡索乙素抗嗎啡條件性位置偏愛效應機制研究和效果比較. 中國中藥雜志,2012,37(22): 3457-3461.

7 史未名.美洲大蠊的藥用研究進展.中國民族民間醫藥,2012,3: 50-51.

8 吳宗英,劉紅專,李藝明.康復新液聯合奧美拉唑三聯療法治療胃潰瘍的療效觀察.華西醫學,2012,27(11): 1614-1616.

9 劉玉媛.天然藥物康復新液的臨床應用.天津藥學,2006,18(3): 55-57.

10 賀勁松,周大橋,高輝,等.消癥益肝片治療慢性乙型肝炎肝纖維化30例臨床觀察.中醫藥導報,2006,12(9): 22-23.

11 李晨晨,熊永愛,譚承佳,等. 美洲大蠊對小鼠急性酒精性肝損傷的藥理作用研究. 世界科學技術-中醫藥現代化,2014,4(16): 758-761.

12 吳紅梅,李晨晨,劉楠,等.閃式與回流提取美洲大蠊總氨基酸的工藝比較.中國實驗方劑學雜志,2012,18(21): 52-53.

13 楊芳,邵金良,汪慶平,等. 美洲大蠊水解氨基酸含量測定及營養評價. 氨基酸和生物資源,2010,32(1): 9-11.

14 王加黨,李艷玲,賀永梅,等.影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸測定的因素研究.大理學院學報,2011,10(12): 12-15.

15 李晨晨,賈成友,郭華,等.正交試驗法優化美洲大蠊糖蛋白的提取工藝.成都中醫藥大學學報,2014,37(3): 4-7.

16 靳瑞婷,李雪峰,陶永華,等. Box-Behnken法設計優化川芎浸膏真空帶式干燥工藝. 世界科學技術-中醫藥現代化,2015,17 (7): 1454-1459.

17 朱海琳,孟兆青,丁崗,等. 響應面法優化續斷中川續斷皂苷Ⅵ的超聲提取工藝. 世界科學技術-中醫藥現代化,2014,17(8): 1777-1783.

18 劉懷偉,鄒俊波,張廷模,等.Box-Behnken設計優化石斛清咽含片提取工藝.中國實驗方劑學雜志,2014,20(21): 17-20.

19 王玎瑋,李海波,蔣學云,等.美洲大蠊藥材中總氨基酸提取工藝優化研究.大理學院學報,2008,7(12): 3-5.

Optimizing Extraction Process of Free Amino Acid in Periplaneta americana L. by Box-Behnken Design

Zou Junbo,Xiong Yongai,Sang Wentao,Yang Shengqun
(The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine / Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province / Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and MOST ,Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese MedicineKey Laboratory of Systematic Research,Chengdu 611137,China)

This study aimed to optimize the extraction process of free amino acid in Periplaneta americana L. by Box-Behnken design-response surface methodology. On the basis of single factor screening,a three-factorand three-level Box-Behnken experimental design was employed with extraction time (X1),solvent ratio (X2) and solvent concentration (X3) as independent variables. And extraction frequence was also involved in a major impact. Dependent variables were transformed into desirability mathematically by comprehensive evaluation method and Hassan's method. Data of overall desirability was fitted to a second order polynomial equation,through which three dimensional response surface graphs were produced. Optimum experimental conditions were selected from the stationary point of the response surfaces. Through the Box-Behnken design-response surface methodology and prognostic scoring system optimized scheme,the preferred processing conditions were as follows: added 12 times of 70% ethyl alcohol,extracted twice with each for 120 min. The content of amino acid and the dry extra yield actually extracted were in coordinence with the disrable values. In conclusion,the extraction technology of free amino acid optimized by Box-Behnken Design was practical and feasible with good fitting degree for predicting indexes (e.g. free amino acid and dry extra yield) in Periplaneta americana L..

Free amino acid,Periplaneta americana L.,Box-Behnken experimental design,overall desirability

10.11842/wst.2016.05.033

R286

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2015-10-14

修回日期：2015-12-26

＊ 四川省科技廳項目（2014TD0007）：中藥藥理四川省青年科技創新研究團隊，負責人：曾南。

＊＊ 通訊作者：鄒俊波，在讀博士，主要研究方向：中藥藥效與毒理研究。