人肺腺癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定*

楊佳　方志紅　吳建春　徐靜　殷曉聆　趙凡塵　李雁

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人肺腺癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定*

楊佳方志紅吳建春徐靜殷曉聆趙凡塵李雁

摘要目的：從人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及H1299中分離富集含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞球并鑒定其生物學(xué)特性。方法：用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的方法從人肺腺癌A549及H1299細(xì)胞株中富集得到腫瘤細(xì)胞球。將腫瘤細(xì)胞球傳代擴(kuò)增，體外利用CCK-8法、平皿克隆以及Transwell小室實(shí)驗(yàn)，研究細(xì)胞球的增殖情況、自我更新和侵襲轉(zhuǎn)移能力；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog基因表達(dá)情況；體內(nèi)利用裸鼠移植瘤形成實(shí)驗(yàn)研究肺癌細(xì)胞球的成瘤能力。鑒定細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞特性。結(jié)果：在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)下，A549及H1299細(xì)胞株3～6天后能形成穩(wěn)定傳代的腫瘤懸浮球，懸浮球的體外自我更新、克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移等能力均高于其親本細(xì)胞（P<0.05）；干細(xì)胞核心基因Oct4和Nanog的mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；A549懸浮球可以明顯提高裸鼠體內(nèi)成瘤能力。結(jié)論：通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法可有效富集A549及H1299細(xì)胞系中的干細(xì)胞成分，該法可成為快速易行構(gòu)建肺腺癌干細(xì)胞模型的方法。

關(guān)鍵詞肺腺癌腫瘤干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)分離鑒定

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科（上海市201203）

*本文課題受?chē)?guó)家自然基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81473627）和上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（編號(hào)：20124078）資助

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中肺腺癌的比例占40%以上，盡管近些年在肺癌防治和分子靶向研究方面有了較大突破，但肺癌患者的5年生存率仍未超過(guò)17%［1］。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)在越來(lái)越多的腫瘤中被證實(shí)和認(rèn)可，該理論認(rèn)為肺癌干細(xì)胞是導(dǎo)致肺癌快速進(jìn)展、耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源，其為肺癌組織中一群數(shù)量極少但具有高致瘤性、自我更新、分化潛能和耐藥性的細(xì)胞［2］。因此，研究肺癌干細(xì)胞將對(duì)肺癌的治療產(chǎn)生重要意義，其第一步就是分離和富集肺癌干細(xì)胞。目前，肺癌干細(xì)胞的構(gòu)建方法主要有通過(guò)特定標(biāo)記物（流式或免疫磁珠）分選或功能學(xué)（SP、EMT、無(wú)血清懸浮）分選［3］等，尚無(wú)公認(rèn)的針對(duì)肺癌干細(xì)胞的特異性干細(xì)胞標(biāo)記物［4］。

本研究采用無(wú)血清非黏附培養(yǎng)法對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及H1299進(jìn)行分離和富集，并對(duì)富集的懸浮球進(jìn)行一系列體、內(nèi)外腫瘤干細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)鑒定；旨在建立一種適用于體外快速構(gòu)建肺腺癌干細(xì)胞的通用方法，為肺癌干細(xì)胞的深入研究提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及動(dòng)物人肺腺癌細(xì)胞株A549和H1299購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（ATCC）。4～5周齡雄性BALB/c裸鼠購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)［SCXK（滬）2012-0002］，體質(zhì)量18～22 g，雄性，于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，0.25%胰酶-EDTA（美國(guó)HyClone公司），重組人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bF?GF）均購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，B27（美國(guó)Invitrogen公司），重組人胰島素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鼠抗人Oct4和Nanog單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司），兔抗人GAPDH單克隆抗體（美國(guó)CST公司）；鼠抗兔IgG（美國(guó)CST公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMSO（美國(guó)Sigma公司）；Transwell小室（美國(guó)BD公司），Matrigel膠（美國(guó)BD公司），低黏附培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RTPCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分為A549及H1299貼壁細(xì)胞組和A549及H1299懸浮球組。A549及H1299貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FBS的RPMI 1640，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2懸浮球培養(yǎng)采用0.25%胰酶將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H1299細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，100 rpm/min離心5 min后棄上清，將細(xì)胞按3×104個(gè)/孔的密度，平鋪到超低黏附6孔板中；每孔加無(wú)血清培養(yǎng)液3～4 mL，無(wú)血清培養(yǎng)液DMEM/F12中含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、20 μL/mL B27，重組人胰島素4 μg/mL。每隔2～3 d半量換液，每隔4～6 d傳代，顯微鏡下分別觀察A549及H1299細(xì)胞的成球情況，實(shí)驗(yàn)用第3代以后的懸浮球。

1.2.3CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)分別將兩種貼壁細(xì)胞和懸浮球胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞2×103個(gè)/孔的密度加入96孔板中，用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640加10%FBS）培養(yǎng)，以單一培養(yǎng)液組作為空白組，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。于接種后連續(xù)6天，每隔24 h測(cè)細(xì)胞數(shù)。加入10 μL/孔CCK-8，上酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值。縱坐標(biāo)為A490平均數(shù)，橫坐標(biāo)為天數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)將A549、H1299貼壁細(xì)胞及其懸浮球胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按細(xì)胞200個(gè)/孔的密度分散鋪于普通6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入2 mL含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，2～3 d換液。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d，棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定10 min后，用1%的結(jié)晶紫染色。觀察形成的克隆數(shù)目，其中以>50個(gè)細(xì)胞的克隆為陽(yáng)性克隆。1.2.5 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)將Matrigel膠和無(wú)血清培養(yǎng)液按1:5比例混勻成80 μL，平鋪于小室底部，避免氣泡產(chǎn)生，置于37℃培養(yǎng)中孵育4～5 h；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、H1299貼壁親本細(xì)胞和A549、H1299懸浮球細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按每孔1×105/ 100 μL接種于Transwell小室上層，用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)，下室用含15%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中24 h后取出。用棉棒輕輕擦去小室上層細(xì)胞，染色固定漂洗后，于顯微鏡下隨機(jī)取中央?yún)^(qū)的5個(gè)視野，計(jì)算浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)［5］，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)收集A549、H1299貼壁細(xì)胞及其懸浮球，用Trizol法提取總RNA，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用2-ΔΔCT法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由上海生工生物工程有限公司合成。實(shí)驗(yàn)所需引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)4～5周齡雄性BALB/c裸鼠（購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)［SCXK（滬）2012-0002］，測(cè)定質(zhì)量后隨機(jī)分組，每組5只，將收集好的A549、H1299貼壁細(xì)胞和A549 sphere、H1299 sphere細(xì)胞懸液按照每只1×106個(gè)/200 μL（重懸于無(wú)血清DMEM/ F12培養(yǎng)液中）分別注射于裸鼠背部皮下的左、右兩側(cè)，左側(cè)接種貼壁細(xì)胞，右側(cè)接種懸浮球細(xì)胞。注射后3 d起觀察移植瘤形成情況，每3天測(cè)量一次腫瘤體積［V=a×b2/2（a為長(zhǎng)徑，b為短徑）］，連續(xù)4周。28 d后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤稱(chēng)重、測(cè)量瘤體積，并繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以±s表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞懸浮球培養(yǎng)

A549及H1299細(xì)胞株在含10%FBS的培養(yǎng)液中呈梭形貼壁生長(zhǎng)（圖1A、B），而在含各種刺激因子的無(wú)血清培養(yǎng)液中細(xì)胞1～3 d后懸浮分散于低黏附培養(yǎng)板中，形成若干大小、形態(tài)不等的懸浮球，其余散在細(xì)胞逐漸凋亡（圖1C、D），6～8 d培養(yǎng)后，細(xì)胞呈球形或橢圓形立體生長(zhǎng)，平均直徑增大，懸浮球數(shù)目增多，球內(nèi)細(xì)胞結(jié)合緊密，球體飽滿，折光性強(qiáng)（圖1E、F）。表明在連續(xù)無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)黏附板條件下能成功誘導(dǎo)A549及H1299細(xì)胞株形成具有自我更新能力的干細(xì)胞球。

2.2細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力

用CCK-8法分別檢測(cè)A549、H1299及其懸浮球細(xì)胞隨天數(shù)增加的增殖情況，并繪制生長(zhǎng)曲線。觀察發(fā)現(xiàn)A549及H1299懸浮球細(xì)胞大約從第4天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第8天進(jìn)入平臺(tái)期，而普通A549及H1299細(xì)胞直到第6天才開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。表明無(wú)論在A549還是H1299細(xì)胞系中，懸浮球的增殖能力均明顯高于親代貼壁細(xì)胞（P<0.05，圖2A、B）。進(jìn)一步通過(guò)平皿克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)懸浮球克隆形成能力，將A549、H1299及其懸浮球細(xì)胞以同等數(shù)目分別接種于普通6孔板，每組做3個(gè)復(fù)孔。經(jīng)過(guò)10 d的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)懸浮球形成的克隆數(shù)［A549懸浮球（87± 3）、H1299懸浮球（92±6）］顯著高于貼壁親代細(xì)胞［A549（17±5）、H1299（32±3），（P<0.05，圖2C、D）］。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，A549及H1299懸浮球均比其貼壁親代細(xì)胞具有更強(qiáng)的干細(xì)胞特性—自我更新能力；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)由于細(xì)胞系之間的差異，在相同培養(yǎng)條件和天數(shù)下，H1299懸浮球細(xì)胞生長(zhǎng)速度要比A549懸浮球更快，克隆形成的數(shù)目更多。

2.3細(xì)胞侵襲能力

A549細(xì)胞球穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)為（94±14）個(gè)/視野，多于A549貼壁細(xì)胞的（38±5）個(gè)/視野（t=6.71，P<0.01，圖3A、B）；H1299細(xì)胞球穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)為（117±19）個(gè)/視野，多于H1299貼壁細(xì)胞的（38± 5）個(gè)/視野（t=5.74，P<0.01，圖3C、D）。隨機(jī)取中央?yún)^(qū)的5個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，做統(tǒng)計(jì)圖3E，顯示培養(yǎng)的懸浮球細(xì)胞比貼壁親代細(xì)胞具有更強(qiáng)的干細(xì)胞特性—侵襲轉(zhuǎn)移能力。

圖1　顯微鏡下觀察細(xì)胞及細(xì)胞球生長(zhǎng)情況（×200）Figures 1　The cell growth under microscope (×200)

2.4干性相關(guān)基因表達(dá)的比較

通過(guò)qPCR檢測(cè)在A549、H1299貼壁細(xì)胞及其懸浮細(xì)胞球中的干性轉(zhuǎn)錄因子Nanog和Oct-4表達(dá)差異：A549貼壁細(xì)胞vs懸浮細(xì)胞球組中Nanog［（1.00± 0.34）vs（25.61±1.21），P<0.005］、Oct-4［（2.35±0.70）vs （7.22±0.37），P<0.05］；H1299貼壁細(xì)胞vs懸浮細(xì)胞球組中Nanog［（1.00±0.34）vs（27.32±0.54），P<0.005］、Oct-4［（1.59±0.67）vs（4.22±0.37），P<0.05］。提示在mRNA水平，懸浮球中干細(xì)胞核心調(diào)控基因Nanog和Oct4的表達(dá)明顯升高，而大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，這兩個(gè)因子在多種腫瘤干細(xì)胞中均表達(dá)增高，提示所培養(yǎng)的懸浮球細(xì)胞具有干細(xì)胞特性（圖3F）。

2.5體內(nèi)致瘤能力

能否在體內(nèi)成功建立腫瘤移植瘤模型是檢驗(yàn)CSC的一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”［4，6］。在BALB/c裸鼠背部皮下的左、右兩側(cè)分別接種1×106個(gè)細(xì)胞（正常A549細(xì)胞系裸鼠皮下成瘤，每只接種細(xì)胞數(shù)為4×106～8×106個(gè)細(xì)胞），左側(cè)接種貼壁細(xì)胞，右側(cè)接種懸浮球細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1×106個(gè)細(xì)胞的情況下，H1299細(xì)胞系無(wú)論是貼壁細(xì)胞還是懸浮球細(xì)胞，均難以形成瘤塊，可能與H1299細(xì)胞系本身有關(guān)。A549細(xì)胞系中的懸浮球細(xì)胞成瘤能力要明顯強(qiáng)于貼壁細(xì)胞組，成瘤潛伏期要短于貼壁細(xì)胞組，A549懸浮球細(xì)胞在第3～5天時(shí)，一組的5只裸鼠皮下均可見(jiàn)一明顯包塊，而貼壁細(xì)胞組直至第12天時(shí)，才均陸續(xù)長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)瘤體；且瘤塊體積隨天數(shù)迅速增大，相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞球組瘤體重量也較后者要重（圖4）。說(shuō)明A549細(xì)胞球在較少的細(xì)胞數(shù)下，具有更強(qiáng)的體內(nèi)致瘤能力。

圖2　細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力比較Figure 2　The ability of cell proliferation and colony formation

圖3　細(xì)胞侵襲能力和干性相關(guān)基因的檢測(cè)Figure 3　The detection of cell invasion and stem cell genes

圖4　體內(nèi)成瘤能力分析Figure 4　Tumorigenic capacity analysis

3　討論

有關(guān)腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）理論一直存在各種爭(zhēng)議。自1997年，從白血病中分離提取出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞后，在越來(lái)越多的實(shí)體腫瘤中均分離并鑒定出腫瘤干細(xì)胞［7］，這個(gè)學(xué)術(shù)觀點(diǎn)逐漸被大家所接受。CSCs理論認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一類(lèi)數(shù)量極少但具有極強(qiáng)自我更新、增殖分化潛能的細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥的根源。腫瘤干細(xì)胞理論的提出，為人們解決腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，放、化療后的耐藥提供了新的視角，為深入研究腫瘤機(jī)制及靶向治療提供可能。

通過(guò)SP細(xì)胞或表面標(biāo)記物篩選法［8］、分子克隆構(gòu)建法［9］、EMT耐藥培養(yǎng)法［10］及無(wú)血清懸浮培養(yǎng)［6，11］等方法分離和富集肺癌中的干細(xì)胞成分，已成為主要方法。然而這些方法都有一定的自身適用性和局限性。側(cè)群細(xì)胞SP細(xì)胞在Hoechst 33342染色分離過(guò)程中，可因染料的毒性而干擾其成瘤能力；依靠特異性標(biāo)記物流式分選出的陽(yáng)性干細(xì)胞亞群數(shù)量少，后續(xù)培養(yǎng)壽命短暫，不利于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。且由于不同分型的細(xì)胞存在異質(zhì)性，肺癌干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物（CD133［12］、CD44［13］、ALDH［14］等）存在較大爭(zhēng)議，一部分研究認(rèn)為CD133+肺癌細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，CD133可作為肺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物；而另一部分研究則認(rèn)為肺癌干細(xì)胞中CD133的表達(dá)并非陽(yáng)性［15］，H446和A549細(xì)胞系中CD133-細(xì)胞也含腫瘤干細(xì)胞成分［16］。無(wú)血清懸浮球培養(yǎng)法最早應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞，目前已在眾多實(shí)體腫瘤（乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等）［17-19］中均得以證實(shí)。肺癌中已分別有報(bào)道A549［16］、H460［6］等細(xì)胞通過(guò)懸浮培養(yǎng)液條件形成具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，但尚未在同一個(gè)肺腺癌細(xì)胞系上，用同樣的懸浮條件驗(yàn)證2種以上的細(xì)胞系；這樣既可規(guī)避因其組織來(lái)源異質(zhì)性而存在的差異，同時(shí)又能較清楚地闡明不同分型下的腺癌類(lèi)型；懸浮球培養(yǎng)法原理利用只有CSCs相對(duì)未分化的細(xì)胞才能夠在SFM中懸浮生長(zhǎng)并不斷增殖，而普通高分化的腫瘤細(xì)胞則因無(wú)法耐受這種無(wú)血清的生長(zhǎng)環(huán)境出現(xiàn)凋亡［5］。此法雖然也存在著培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞比例不純、容易隨著代數(shù)的增加而日益分化問(wèn)題，但因其成本低，可方便快捷地分離富集CSC樣細(xì)胞而得到越來(lái)越多的應(yīng)用。

本研究初步探討了利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法從肺腺癌細(xì)胞A549及H1299中分離富集了可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞球，并對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行了一系列驗(yàn)證，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞球平均直徑增大，懸浮球數(shù)目增多。通過(guò)體外CCK-8、平皿克隆和Transwell小室等實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)血清懸浮培養(yǎng)獲得的懸浮球比貼壁親代細(xì)胞具有明顯干細(xì)胞特性—強(qiáng)增殖性和侵襲轉(zhuǎn)移性。進(jìn)一步檢測(cè)了懸浮球中Oct4和Nanog的表達(dá)，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和Sox2、Klf4［20］構(gòu)成了胚胎干細(xì)胞的核心調(diào)控因子，是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多潛能的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)。近年來(lái)被廣泛證實(shí)，在多種實(shí)體腫瘤干細(xì)胞中均呈現(xiàn)較高表達(dá)，Oct4和Nanog與肺癌干細(xì)胞關(guān)系尤為密切［21］，肺腺癌患者腫瘤組織中這兩個(gè)基因高表達(dá)者，預(yù)后均較差，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)懸浮球中這2個(gè)基因的表達(dá)均明顯高于貼壁親本細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Nanog差異尤為明顯，可增高25倍（P<0.001）。另一方面，通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)，將A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞在同等較少的細(xì)胞數(shù)目下，接種于同一只裸鼠的左右兩邊，發(fā)現(xiàn)懸浮球組成瘤潛伏期、瘤體生長(zhǎng)速度、瘤體積等成瘤能力指標(biāo)均遠(yuǎn)強(qiáng)于貼壁細(xì)胞組。而H1299細(xì)胞系，無(wú)論其親代細(xì)胞或是懸浮球細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次嘗試，均無(wú)法在裸鼠體內(nèi)皮下成瘤，可能與細(xì)胞、鼠系差異有關(guān)。以上通過(guò)體內(nèi)、體外的一系列實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法可有效分離、富集到具有干細(xì)胞特性的肺癌細(xì)胞［11］。

本研究在肺癌的兩個(gè)細(xì)胞系通過(guò)同樣的構(gòu)建方法加以嘗試，避免了因其組織來(lái)源異質(zhì)性而存在的差異，雖然A549懸浮球的干細(xì)胞特性并非與H1299懸浮球完全一致，但和親代貼壁細(xì)胞相比，均表現(xiàn)了更強(qiáng)的干細(xì)胞特性。表明通過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法可以培養(yǎng)出具有干細(xì)胞特性的肺腺癌細(xì)胞株。作為一個(gè)快速易行的構(gòu)建干細(xì)胞模型方法，為肺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的深入研究及靶向藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

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（2015-12-20收稿）

（2016-01-15修回）

（編輯：楊紅欣校對(duì)：鄭莉）

楊佳專(zhuān)業(yè)方向?yàn)槟[瘤臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail：jiajiayy07@163.com

·臨床研究與應(yīng)用·

Isolation and identification of lung cancer stem like cells from human lung adenocarcinoma cell lines

Jia YANG, Zhihong FANG, Jianchun WU, Jing XU, Xiaolin YIN, Fanchen Zhao, Yan LI
Correspondence to: Yan LI; E-mail: 18916767226@163.com
Department of Oncology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Shanghai Chinese Medicine Hospital, Shanghai 201203, China
This work were supported by the Key Project of National Natural Science Foundation of China (No.81473627) and Project from Shanghai Municipal Health Bureau (No.20124078)

AbstractObjective: To isolate cell spheres containing cancer stem cells (CSCs) from lung cancer cell lines (A549 and H1299) and identify their biological characteristics. Methods: By adopting the method of serum-free suspension culture, A549 cells and H1299 cells were cultured on no-adhesion plate to form tumor spheres. Clone assay, CCK-8 assay, and Transwell assay were employed to observe proliferation, self-renewal and invasion of tumor spheres. Besides, RT-PCR was performed to compare the expression levels of stem cell markers between sphere cells and adherent cells. Adherent A549 cells and A549 cell spheres were inoculated subcutaneously in nude mice and the tumor growth was assessed. Results: Isolated CSCs from A549 cells and H1299 cells in serum-free medium (SFM) without adhesion could grow as floating cell spheres. The results demonstrated that the self-renewal, proliferation and invasion of A549 and H1299 sphere cells were stronger than parent cells (P<0.05). When compared with adherent cells, the mRNA level of expression of cell spheres' stem cell markers (Oct4 and Nanog) were significantly high (P<0.05) and A549 spheres had a stronger tumorigenicity in nude mice. Conclusion: SFM without adhesion can be a quick and easy method to construct stem cells model from human lung adenocarcinoma cell lines A549 and H1299.

Keywords:lung adenocarcinoma, cancer stem cell, serum-free culture, isolation, identification

作者簡(jiǎn)介

通信作者：李雁18916767226@163.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.03.441