狼瘡腎炎蛋白質組學和代謝組學的研究進展

李鞠，談文峰，孟德釬，唐鳳英，張繆佳

(1.南京醫科大學第一附屬醫院 風濕免疫科，江蘇 南京 210029；2.南京醫科大學附屬淮安第一醫院風濕免疫科，江蘇 淮安 223300；3.南京醫科大學附屬淮安第一醫院 腎內科，江蘇 淮安 223300)

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·綜 述·

狼瘡腎炎蛋白質組學和代謝組學的研究進展

李鞠1，2，談文峰1，孟德釬2，唐鳳英3，張繆佳1

(1.南京醫科大學第一附屬醫院 風濕免疫科，江蘇 南京 210029；2.南京醫科大學附屬淮安第一醫院風濕免疫科，江蘇 淮安 223300；3.南京醫科大學附屬淮安第一醫院 腎內科，江蘇 淮安 223300)

狼瘡腎炎(LN)是系統性紅斑狼瘡(SLE)最嚴重的表現之一，腎臟損害的嚴重程度與SLE的預后密切相關。LN發病涉及到多種因素，包括遺傳易感性、表觀遺傳調控和環境。近十來年基于組學的技術(包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學)已廣泛地用于SLE及LN生物標志物篩選和疾病的分型分類。這些研究深化了我們對疾病分子基礎的認識，對識別潛在治療靶點、疾病的早期預測及治療非常重要。本文作者就最近幾年狼瘡腎炎蛋白質組學及代謝組學的相關研究進展作一綜述。

狼瘡腎炎；蛋白質組學；代謝組學；標志物；綜述

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種以多種自身抗體產生，累及重要器官包括腎、腦、心血管、關節和皮膚等部位的慢性自身免疫性疾病。狼瘡腎炎(LN)是SLE中最常見的并發癥，是SLE患者的主要死因之一[1]。其發病機制包括腎小球內自身抗體的沉積、補體和巨噬細胞的活化、細胞增殖及細胞外基質蛋白的產生、促炎癥細胞因子和趨化因子聚集、多種機制共同引起腎小管損害以及腎間質炎癥和纖維化。迄今，LN作為SLE嚴重的并發癥之一，仍然是一個重大的挑戰[2]。尋找可靠的LN的生物標志物，將有助于評估病情、確定腎臟損傷風險指數并促進早期診斷和干預以改善預后[3]。連鎖分析和全基因組關聯研究(GWAS)篩選揭示狼瘡一部分易感基因位點[4-5]，但這些位點只占疾病遺傳的一小部分。人類疾病廣泛存在表觀遺傳機制，包括DNA的甲基化以及組蛋白和微小RNA的改變等，這些變化最終形成不同級別的蛋白質和小分子代謝生物標志物。

1 蛋白質組學

蛋白質組學(proteomics)，即高通量地確定某一細胞、組織或器官的全套蛋白質的特征，包括表達水平、結構及功能的特征等。通過對比正常人群、LN患者以及不同亞類LN患者之間體液或組織表達譜，篩選出差異表達的蛋白質，可能對疾病診斷、病情判斷及預后估計有重要的價值，并可進一步探討疾病的發病機制。

1.1 血清蛋白組學

Morgan等[6]采用表面增強激光解吸電離(SELDI)結合質譜技術分析了LN患兒與同性同齡正常對照組血清蛋白表達譜的差異，篩選出一個由5個亞基(相對分子質量分別為22、23、44、79和100 000)構成的蛋白質在LN患兒中明顯高于對照組，該差異蛋白對診斷的敏感型和特異性均在90%以上。Serada等[7]應用二級雙向電泳液相色譜—串聯質譜的方法鑒定出醛縮酶A是LN患者血清標志物。有研究[8]應用48叢抗體芯片檢測LN血清標志物，結果顯示早期LN患者中血清補體C1q降低，白細胞介素-6和低密度脂蛋白增加。一種多重蛋白微陣列[9]用來分析LN患者及LN小鼠模型血清中的自身抗體并被推斷是發現新的自身抗體的有利工具。Bruschi等[10]洗脫來自LN患者腎小球激光捕獲的抗體，用雙向電泳與足細胞蛋白質免疫印跡反應，結合光譜質譜及基質輔助激光解吸電離(MALDI)質譜的技術發現11種差異蛋白質并驗證了烯醇酶和膜聯蛋白A1兩種抗原蛋白質。

1.2 尿蛋白組學

尿液具有獲取簡便、無創傷性、能大規模重復取樣并與腎臟功能密切相關等特點。表面增強激光解吸離子時間飛行質譜技術的發展，多個樣本可同時檢測，所需尿液量少(5～10 μl)，并能檢測低于20 kDa的低分子質量蛋白質，使得關于LN尿液蛋白質組學的研究日益增多[11-13]。表面增強激光解吸電離蛋白質芯片飛行時間(SELDI-TOF)主要的缺點就是可以識別蛋白形態但不能確定具體為哪一種蛋白質。通過SELDI-TOF質譜最初篩選，利用集成芯片上的蛋白質測序或液相色譜串聯質譜法LC/MS/MS可以鑒定具體的蛋白質[14]。

Suzuki等[15]應用基質輔助激光解析電離飛行時間(MALDI-TOF)法檢測出LN患兒尿中轉鐵蛋白、銅藍蛋白、α-酸性糖蛋白(AGP)、脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)、白蛋白和白蛋白相關片段表達異常并與疾病活動度相關，其中轉鐵蛋白、α-酸性糖蛋白、脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶在患者出現臨床癥狀之前便顯著升高。然而，Suzuki等并沒有分析這些蛋白質是否與狼瘡的不同病理類型相關。Oates等[16]采用經典2DE結合MALDI-TOF的方法鑒定出α-酸性糖蛋白具有診斷LN的高敏感性。但有學者發現AGP和L-PGDS亦是成人糖尿病腎病的預測指標[17]，表明這兩種蛋白不是LN的特有指標。Lee等[18]用SELDI-TOF的方法發現，肝殺菌肽20和血清蛋白碎片的排泄在LN發生4個月前便顯著上升，而肝殺菌肽26在疾病發生時排泄減少，證實了上述一些蛋白質可作為LN的標志物。Mosley等[19]用SELDI-TOF的方法區分活動期和靜止期LN患者，質荷比為3 340和3 980的兩種蛋白質在兩組病例中的排出量具有顯著差異，但沒有得到更進一步的驗證。Zhang等[11]發現LN 3種低分子潛在標志物，分別是肝殺菌肽的20和25氨基酸亞型、白蛋白及1-α抗胰蛋白酶碎片。其中，肝殺菌肽與LN患者體內的促炎癥細胞因子密切相關。肝殺菌肽由白介素-6和腫瘤壞死因子調節，并參與LN的發生發展[20]。肝殺菌肽20在病情復發前4個月濃度增加，而肝殺菌肽25在病情緩解后含量回到基線水平，表明肝殺菌肽20可以用來預測病情復發，而肝殺菌肽25可能是治療有效的標志物。

Varghese等[21]結合MALDI-TOF MS和人工神經網絡分析發現11種尿蛋白與局灶階段性腎小球硬化，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型LN及糖尿病腎病相關。此外，這些蛋白質區分LN和局灶性節段性腎小球硬化癥、膜性腎病、糖尿病腎病的敏感性和特異性分別為86%、89%。他們分別是AGP、轉鐵蛋白、α-1-微球蛋白、鋅α-2糖蛋白-1-抗胰蛋白酶、B補充因子、觸珠蛋白、甲狀腺素運載蛋白、血漿視黃醇結合蛋白、白蛋白和血液結合素，但這個研究結果沒有在隨后的人群中重復出來[22]。

Wu等[23]用2D凝膠電泳的方法分離出LN小鼠尿中的71種差異表達蛋白質，并驗證了4種蛋白質標志物為前列腺素D合成酶(PGDS)、腎素或總蛋白酶、血清淀粉樣蛋白(SAP)以及超氧化物歧化酶(SOD)。LN患者尿液中PGDS和酶分解產物PGD2、SOD、總蛋白酶以及SAP升高，并與腎臟病理類型相關。這4種代謝產物預測腎小球腎炎積分及病理活動指數優于傳統的指標24 h尿蛋白和尿素氮，其中總蛋白酶具有最強的疾病活動相關性。

1.3 腎臟組織蛋白質組學

LN病理類型多樣，可表現為慢性腎炎綜合征、腎病綜合征甚至急進性腎炎，病程呈慢性緩解和急性發作交替的特點，直接影響其預后。目前主要依靠腎臟穿刺活檢病理檢查對LN進行分級分期，但腎活檢有創傷性，較多患者不接受，少部分患者存在腎活檢禁忌證，且活檢取材對早期腎病變的灶性、輕微階段也存在一定的漏診率。因此，對早期狼瘡性腎炎患者進行蛋白質組學檢查，尋找特異性生物標志物，對狼瘡腎臟病變的早期認識及確定分型分期是十分重要的內容。Sui等[24]應用定量蛋白質組學技術對Ⅴ型LN腎組織中的“全組”蛋白進行鑒定和定量分析，與正常對照組比較，實驗腎組織中共篩選出10個明顯上調蛋白和8個明顯下調蛋白，并鑒定出上調蛋白中的不均質核內核糖核蛋白、核纖層蛋白A、膜聯蛋白和下調蛋白中的精氨(基)琥珀酸合成酶、醛縮酶等參與LN的潛在致病過程。Alaiya等[25]應用二維凝膠雙向電泳(2-DE)和質譜分析蛋白組方法結合檢測Ⅳ型LN(彌漫增殖和局灶階段)、抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎及正常腎組織4組樣本，結果顯示無法區分彌漫增殖和局灶階段硬化組，但建立的主成分分析(PCA)模型能顯著區分Ⅳ型LN組與抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎及正常腎組織組。目前關于狼瘡腎臟組織蛋白質組學的研究尚少，需要更多的動物及臨床實驗來進一步深入探討。

2 代謝組學

代謝組學是一門研究生物體樣本或器官的小分子代謝產物的科學。通過代謝組學的研究不僅可以了解LN病變的發生、發展以及治療過程中機體的狀態和變化，還可以探索外界干擾因素(微生物、環境、飲食、藥物、毒物及生活方式等)對患者的影響，為LN的診斷、防治、病理機制的探索、臨床治療方案的評價甚至新治療靶點的發現提供了新的途徑和思路。

2.1 血清代謝組學

LN作為SLE的最常見的并發癥，其體內代謝組譜應該有和SLE相似之處。第一個研究SLE代謝組學是應用LC/MS和氣相色譜質譜(GC-MS)聯合的方法發現SLE患者存在血清中能量產物的減少、氧化應激產物增多、炎癥活性標志物升高以及脂質代謝紊亂[26]。另一個則采用核磁共振光譜分析發現SLE患者血清中能量產物減少，低密度脂蛋白和乳酸增加[27]。近來Nowling等[28]通過代謝組學方法發現狼瘡小鼠及LN患者中糖磷脂代謝紊亂，提示糖磷脂通路可能成為LN的早期診斷標志物。后續的研究可以直接圍繞尋找調節磷脂代謝通路的治療靶點以延緩LN患者的動脈粥樣硬化血管病變進程。此外，通過代謝組學確定循環血液中活性鞘脂類水平[29]并在臨床實驗室進行驗證可能成為SLE診斷和估測預后的重要方法。糖組學包括游離糖及結合蛋白或脂類的糖的研究，研究碳水化合物對自身免疫性疾病的影響是一個新穎具有希望的領域[30-31]。

2.2 尿液代謝組學

Romick-Rosendale等[32]發現，?；撬岷蜋幟仕徇@兩個尿液中的代謝產物能夠準確地將增生性(LN Ⅲ/Ⅳ型)和單純系膜病變LN(Ⅴ型)患者區分開。Ⅲ/Ⅳ型LN患者尿液中的?；撬釢舛缺娶跣突颊叩?0倍多(P<0.01)。而Ⅴ型LN患者尿液中的檸檬酸濃度比Ⅲ/Ⅳ型患者低8倍多(P<0.05)。此外，尿液中的馬尿酸鹽能將該鹽濃度處于正常水平的Ⅴ型患者與完全缺乏該鹽的FSGS患者區分開(P<0.001)。?；撬岷蜋幟仕岬仁菣z測腎小管細胞功能的標志物[33]。腎臟通過對代謝物進行過濾和重吸收以維持代謝平衡，腎臟病變使腎小球和腎小管對?；撬岷蜋幟仕岬刃》肿哟x物的過濾和重吸收發生紊亂，從而使得代謝圖譜存在差異[34]。魯瑩等[35]采用基于1H-NMR的代謝組學的方法，利用PCA進行小鼠的尿液與血清代謝組數據分析，指出中藥昆仙膠囊可降低狼瘡腎炎MRL/lpr小鼠尿中乳酸、檸檬酸、葡萄糖、谷氨酰胺及丙氨酸水平，并升高α-酮戊二酸、肌酸/肌酐、馬尿酸鹽的水平。

3 結 語

LN是一種臨床和血清學多樣性的自身免疫性疾病，其發病機制復雜，很難用單一的生物學標志物來說明LN廣泛的特性，合適的生物學標志物對于LN早期診斷、治療靶點選擇和判斷預后具有重要價值。蛋白質組學和代謝組學技術結合模式識別分析方法構建機體整體的蛋白差異表達圖譜或代謝指紋圖譜以區分疾病的病理狀態，比傳統的單一標志物更有利于疾病的診斷和療效的監測。蛋白質組及代謝組學的發展為闡明LN的發病機制、判斷疾病不同病理類型及尋找新的藥物治療靶點提供新的思路。

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2016-03-17

2016-05-23

國家自然科學青年基金資助項目(81102684)

李鞠(1984-)，女，江蘇泗洪人，主治醫師，在讀博士研究生。E-mail:liju198461@163.com

張繆佳 E-mail:mjzhang@njmu.edu.cn

李鞠，談文峰，孟德釬，等.狼瘡腎炎蛋白質組學和代謝組學的研究進展[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(5)：789-792.

R593.2

A

1671-6264(2016)05-0789-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．032