3種檢測肺炎支原體感染方法的比較分析

曹波，郁飛，張憲偉，陳紅兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210008)

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·論 著·

3種檢測肺炎支原體感染方法的比較分析

曹波，郁飛，張憲偉，陳紅兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210008)

目的:比較3種檢測方法對肺炎支原體(MP)感染的臨床診斷效果及應(yīng)用價值。方法：對疑為呼吸系統(tǒng)MP感染的494例住院患兒留取痰液，用PCR熒光探針法進(jìn)行MPDNA檢測，用被動凝集法和間接免疫熒光法進(jìn)行血清抗MP抗體檢測。結(jié)果：PCR熒光探針法陽性299例(60.53%)，被動凝集法陽性290例(58.70%)，間接免疫熒光法陽性242例(48.99%)，PCR熒光探針法與被動凝集法的陽性率無差別(χ2=0.341,P>0.012 5)，間接免疫熒光法與PCR熒光探針法(χ2=13.274,P<0.012 5)、被動凝集法(χ2=9.383,P<0.012 5)陽性率相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。被動凝集法陽性結(jié)果中滴度為40的患兒共77例，其中70例的另2種方法結(jié)果均為陽性。結(jié)論：間接免疫熒光法的檢測陽性率低于PCR熒光探針法與被動凝集法。對于兒童，被動凝集法靜脈血標(biāo)本的采集較PCR熒光探針法的痰標(biāo)本采集更為簡便，可將被動凝集法作為MP感染的門診篩查項目；被動凝集法應(yīng)將滴度≥40的結(jié)果判定為陽性。

肺炎支原體；PCR熒光探針法；被動凝集法；間接免疫熒光法

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是兒童時期肺炎或其他呼吸道感染的重要病原體之一，并可有復(fù)雜的肺外表現(xiàn)[1]。MP感染的治療與其他細(xì)菌和病毒感染的治療方案截然不同，及時、有效地進(jìn)行MP感染的實驗室診斷對指導(dǎo)臨床治療，進(jìn)而預(yù)防可能發(fā)生的醫(yī)院內(nèi)流行和并發(fā)癥十分重要[2-3]。我們采用PCR熒光探針法(PCR fluorescence probing)、被動凝集法(passive particle agglutination)、間接免疫熒光法(IFA)3種常用MP感染實驗室診斷方法對疑似MP感染患兒做平行檢測，期望能為臨床醫(yī)師提供準(zhǔn)確的MP感染實驗診斷方法。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2014年11月至2015年3月我院呼吸科疑為呼吸系統(tǒng)MP感染的住院患兒共494例，其中男312例(63.16%)，女182例(36.84%)。

1.2 PCR熒光探針法定量檢測MP

MP核酸定量檢測試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安公司提供。使用一次性吸痰器采集患兒氣管深部分泌物1～3 ml作為痰液標(biāo)本，用4倍體積40 g·L-1的NaOH室溫消化30 min，取1 ml至離心管，15 000 r·min-1離心5 min，用生理鹽水離心洗滌1次，棄上清，加50 μl DNA提取液，混勻，沸水浴10 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液2 μl做PCR檢測。反應(yīng)管置于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司PE5700自動熒光檢測儀，93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 120 s，40個循環(huán)。熒光激發(fā)波長為487 nm，檢測波長為525 nm。反應(yīng)結(jié)束，計算機(jī)自動分析結(jié)果，以拷貝≥5×102為陽性。

1.3 被動凝集法檢測抗MP抗體

按富士瑞必歐株式會社提供的抗MP抗體檢測試劑盒說明書對患兒血清進(jìn)行檢測，滴度≥40為陽性。

1.4 間接免疫熒光法檢測抗MP抗體

按VIRCELL公司提供9項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒說明書對患兒血清進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行3種方法的陽性率比較，用R×2表資料χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。若有差異，再用χ2分割法(partitions ofχ2method)重新規(guī)定檢驗水準(zhǔn)，通過3個獨(dú)立的四格表資料χ2檢驗行兩兩比較，來判斷各方法間的陽性率是否有差別。

2 結(jié) 果

494例受檢患兒中，PCR熒光探針法陽性299例，陽性率60.53%；被動凝集法陽性290例，陽性率58.70%；間接免疫熒光法陽性242例，陽性率48.99%。對3種方法的陽性率行R×2表資料χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.434，P<0.01)。再用χ2分割法，將檢驗水準(zhǔn)重新規(guī)定為α′=0.012 5，通過3個獨(dú)立的四格表資料χ2檢驗行兩兩比較，結(jié)果顯示間接免疫熒光法與PCR熒光探針法(χ2=13.274，P=0.000)、被動凝集法(χ2=9.383,P=0.002)的陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但PCR熒光探針法與被動凝集法的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.341，P=0.560)。

被動凝集法陽性結(jié)果中滴度為40的患兒共77例，占此方法所有陽性標(biāo)本的26.6%，其中70例的另2種方法結(jié)果均為陽性。

各年齡段3種方法所測MP或抗MP抗體陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見表1。

表1 各方法不同年齡段MP或抗MP抗體陽性 例

3 討 論

MP的分離培養(yǎng)和鑒定可客觀反映MP感染的存在，作為傳統(tǒng)的檢測手段，至今仍是支原體鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但費(fèi)時耗力。MP對培養(yǎng)條件要求苛刻，生長緩慢，做出判定需3～4周。當(dāng)標(biāo)本中MP數(shù)量極少、培養(yǎng)基營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)不夠或操作不當(dāng)時，均會出現(xiàn)假陰性[3]。目前臨床實驗室診斷多采用血清學(xué)方法和PCR方法。由于PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步，以標(biāo)記特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，完全閉管式操作，大大減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會，使其同時具備良好的靈敏度和特異性，并可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量[4-6]。本實驗中熒光定量PCR方法的陽性率高于其他兩種方法。被動凝集法的陽性率與熒光定量PCR的相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也是一種高效方法。兒童咳痰能力較差，PCR法多采用吸痰方式來采集標(biāo)本，而吸痰操作要求高，只適用于癥狀較重有吸痰需要的住院患兒。被動凝集法以取樣較為容易的靜脈血清作為標(biāo)本，且實驗用時僅3 h，可單個標(biāo)本檢測，更適合用于門診疑似MP感染患兒的篩查。與這兩種方法相比，間接免疫熒光法的陽性率較低，將影響其對MP感染的診斷效率。

在使用被動凝集法來檢測支原體抗體時，由于兒童抽血依從性差，較難實現(xiàn)雙份血清恢復(fù)期抗體滴度上升4倍或下降為原來的1/4的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床上多用單份血清來檢測。黃海輝等[7-8]認(rèn)為應(yīng)將單份血清抗體滴度≥80或≥160作為血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn);而本實驗被動凝集法滴度為40的陽性標(biāo)本共77例，占所有陽性標(biāo)本的26.6%，其中70例得到本實驗另2種方法的驗證，7例呈陰性。用被動凝集法測定抗MP抗體時，須注意其所測得的抗體90%為抗MP-IgM，但也包含了10%左右的抗MP-IgG。故我們認(rèn)為，對于被動凝集法抗體滴度為40陽性的標(biāo)本，應(yīng)引起臨床重視并結(jié)合患兒臨床癥狀、既往感染情況、影像學(xué)檢查、PCR及其他血清學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷，不能簡單地將滴度為40作為排除MP感染依據(jù)。

與其他MP感染的流行病學(xué)報道相似，本項調(diào)查顯示隨著年齡的增加，MP陽性率明顯增加(P<0.01)，但由于研究對象均為住院疑似MP感染并同時進(jìn)行3種方法檢查的患兒，所以整體陽性率較高，能印證兒童MP感染率隨年齡增高的趨勢，但不能作為流行病學(xué)研究依據(jù)。

目前國內(nèi)外常見的MP感染檢測方法包括培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和PCR方法。由于培養(yǎng)法的局限性，臨床并不常用，故臨床應(yīng)結(jié)合血清學(xué)和PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)，聯(lián)合用于臨床診斷。若血清學(xué)檢測陰性而PCR陽性，可能血清學(xué)檢查時間過早，患者體內(nèi)抗體尚未產(chǎn)生，甚至部分患者不能產(chǎn)生抗體；當(dāng)血清學(xué)方法陽性而PCR陰性時，須考慮近期是否已發(fā)生過支原體感染以及血清學(xué)檢測假陽性的可能。總之，在診斷MP感染時，可將被動凝集法作為MP感染的病原學(xué)篩查項目，將PCR方法作為補(bǔ)充，并結(jié)合臨床癥狀和治療效果綜合判斷，爭取較早的明確診斷。

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2016-01-20

2016-05-23

曹波(1982-)，男，江蘇南京人，主管檢驗師。E-mail:22309437@qq.com

曹波，郁飛，張憲偉，等.3種檢測肺炎支原體感染方法的比較分析[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，35(5)：770-772.

R563.15

A

1671-6264(2016)05-0770-03

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．027