二代測序技術在乳腺癌分子生物學研究中的應用及進展

葉新星，康欣梅

(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院 內三科，黑龍江 哈爾濱 150081)

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·綜 述·

二代測序技術在乳腺癌分子生物學研究中的應用及進展

葉新星，康欣梅

(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院 內三科，黑龍江 哈爾濱 150081)

二代測序研究較為全面系統地檢測了乳腺癌基因組，推進了對乳腺癌發生發展的認識。研究發現了新的驅動突變，總結了突變過程及機制，揭示了乳腺癌的瘤內異質性，并促進了個體化醫療的進展。本文作者綜述二代測序技術在乳腺癌分子生物學領域的最新研究成果。

乳腺癌；二代測序；瘤內異質性；驅動基因；個體化醫療；綜述

癌癥的特點是積累的基因組異常，導致活化癌基因和滅活腫瘤抑制基因，這些差異表達基因被稱為“驅動基因”。因此發現具有顯著突變意義的基因對于明確癌癥的成因、進展過程以及開發新的抗腫瘤治療方法有著重要意義。二代測序技術使我們對乳腺癌分子生物學研究有了進一步認識，具體可以概括為3個方面：(1) 識別新的突變基因；(2) 了解基因突變過程及機制；(3) 探索腫瘤異質性并促進個體化醫學發展。

1 顯著突變基因的識別

在大量的基因突變中只有一小部分使得正常的細胞轉化為有癥狀的癌細胞，這部分突變稱為驅動突變。而大部分突變不賦予克隆增長的優勢，并不為癌癥發展貢獻[1]，這些突變被稱為“乘客”突變。通過二代測序技術對乳腺癌大量數據的分析已成功區分驅動突變和乘客突變，并確定了顯著突變的基因[2]。這些癌癥相關基因及其基因結構的改變可能有助于腫瘤的發生。

2012年二代測序技術的應用以及一系列具有里程碑意義的研究解開了乳腺疾病的突變景觀，乳腺癌基因組學取得重大突破。Stephens等[3]通過對100例ER陽性和ER陰性的原發乳腺腫瘤患者進行外顯子測序識別了7 241個體細胞突變點。Forbes等[4]證實了驅動基因的突變與乳腺癌的發展相關聯，如AKT1、BRCA1、CDH1和GATA3、PIK3CA、PTEN、RB1、TP53、APC基因。與許多腫瘤相關的一些癌基因也存在窩藏驅動突變，更重要的是9個新的癌基因(AKT2、ARID1B、CASP8、CDKN1B、MAP3K1、MAP3K13、NCOR1、SMARCD1、TBX3)被確定，其中7個(除了AKT2和TBX3)是潛在的隱性癌易感基因[3]。AKT2基因被認為是激活的、顯性作用的癌基因，而Tbx3基因突變對其功能的影響尚不清楚[3]。所有這些基因在細胞主要功能方面都扮演著重要的角色，如細胞增殖、DNA修復和轉錄調節。這項研究的一個有趣的發現是，幾個不同的突變過程的出現導致乳腺癌JNK信號的失活，多功能激酶JNK參與許多生理過程，包括細胞的應激反應和細胞凋亡[5-6]。JNK通常作為JUN激酶的活化劑，JNK信號可以直接被MAP3K1、MAP2K4和MAP3K13的突變失活或廢除[5]。此外，PIK3CA和PTEN突變可能導致通過激活Akt抑制JNK信號，也可以磷酸化和抑制MAP2K4[7]。這項研究的另一有意義的發現是不同的患者表現出不同的突變模式(體細胞突變的數量和類型)；這種多種分子機制的概念會引發乳腺癌在不同個體的發展，不同的乳腺癌患者呈現出多樣化的臨床表現，然而，在樣本測試中沒有突變總數和診斷年齡之間的相關性，這項研究表明啟動驅動程序事件后乳腺癌基因組發生大量的基因突變[3]。

乳腺癌以雌激素受體(ER)、PR和Her-2受體的表達水平為依據分為管狀A/B型(Luminal A/B)、基底樣癌(basal-like)、正常樣癌(normal-like)和Her-2過表達型[8]。這4種類型具有不同的基因表達特征，Luminal型乳腺癌具有ER的表達特征。Luminal A型乳腺癌是最常見的亞型，在乳腺導管內的腔上皮通常也具有高表達的基因如GATA3、FOXA1、Bcl-2以及低表達的和細胞增殖相關基因[9]。更為積極的表現型Luminal B型是罕見的，具有更高的組織學分級和增殖指數，它的特點是細胞腔基因的低水平表達和細胞增殖基因的高水平表達[9]。Her2過表達型乳腺癌通常高表達Her2和生長因子受體結合蛋白7(GRB7)，后者也位于17q21 Her2擴增子?；讟尤橄侔┑幕蚝灻ǖ退降腅R受體表達或ER缺失，缺乏Her2過表達，表達的基因通常發生在基底或肌上皮細胞正常的乳房(細胞角蛋白5、6、17)和高水平表達的與細胞增殖相關的基因[8]。

Banerji等[10]對125例患者(4種主要亞型乳腺癌)進行DNA測序，外顯子組測序證實了TP53、PIK3CA、AKT1、GATA3和MAP3K1基因的高頻突變，也第一次證實了CBFB是乳腺癌有意義的突變[10]。突變CBFB只發現在ER+腫瘤，然而，由于樣本太小，不能確定這種突變是否為ER+腫瘤特有。CBFB基因編碼的異二聚體的β亞基核心結合轉錄因子，調節一組特定于造血[11]和成骨[12]的基因。RUNX1是CBFB的合作伙伴，被認為具有腫瘤抑制因子角色[13]?；谶@些數據很容易推測，乳腺癌轉錄因子的失活可能與疾病的病因有關系，未來的研究應該致力于闡明其功能喪失的影響。

癌癥基因組網絡(TCGA)通過整合507例患者的基因組(DNA拷貝數與外顯子)、轉錄組(基因和miRNA的表達)、表觀基因組(DNA甲基化)和蛋白質組學數據，完整地研究了乳腺癌的分子特征[14]。510例乳腺腫瘤的全基因組測序分析確定了30 626個突變和生物信息學分析確定35個體細胞突變，包括在上述研究中所描述的基因，以及一些新的基因，除了PIK3CA(編碼PI3K的催化亞基的基因)基因突變，還確定了PIK3R1(編碼PI3K調節亞基的基因)基因突變。PI3K通路的所有重要的調節器PIK3R1、PIK3CA、PTEN和AKT1進行突變后相互排斥[14]。這項研究表明腫瘤的體細胞突變具有不同的突變模式。雖然管狀乳腺癌體細胞突變率低于基底型乳腺癌和Her-2過表達型，但管狀乳腺癌體細胞突變呈現最多樣化和較高的復發率，這一發現表明這些突變基因在管狀乳腺癌起著驅動作用。Luminal A型乳腺癌體細胞突變最常見的是PIK3CA(45%)，其次是MAP3K1、GATA3、TP53、CDH1和MAP2K4。Stephens等[3]認為MAP3K1和MAP2K4基因突變將導致JNK信號通路的失活或廢除，這些突變間具有互斥性特點。Luminal B型顯著突變的基因具有多樣性的特點，TP53和PIK3CA(各占29%)是最常見的，其他一些TP53通路失活事件(ATM損失和MDM2擴增)也頻繁地發生在這個亞型，相對于A亞型如果假定B型TP53通路失活就可以解釋B亞型為更積極的表型。絕大多數基底樣癌(80%)進行TP53基因突變，只有9%發生PIK3CA突變，細胞腔的顯著突變基因則不存在。在Her2+亞型，頻繁的Her2基因擴增(80%)，表現出混合模式的高頻率的TP53(72%)和PIK3CA(39%)以及低頻率的PIK3R1和PTEN基因突變。

腫瘤相關基因的識別一直是腫瘤研究的一個焦點，二代測序推動了乳腺癌基因組學的研究進展，這一過程的研究定會成為“精準醫學”不可或缺的一部分[15]。

2 了解乳腺癌的突變過程及機制

全乳腺癌基因組測序使我們對乳腺疾病的突變過程有了進一步的了解。研究者應用二代測序技術在21例乳腺癌組織和正常組織中確定了183 916個體細胞發生堿基替換，在這些基因中存在驅動突變，如TP53、GATA3、PIK3CA、MAP2K4、SMAD4、MLL2、MLL3、NCOR1、ERBB2、CCND1、MYC、MDM2、ZNF217、ZNF703[16]。通過二代測序分析可以全面揭示遺傳與環境變化在癌癥基因組內留下的簽名(與不同的DNA損傷和修復的分子機制相關)，每一個突變的過程都會在癌癥基因組上留下一個標記，這是一個特定的突變類型的組合，這個突變的簽名是由每一個突變過程暴露的強度和持續時間決定的[16]。以這種方式確定5種生物學上不同的單核苷酸替換過程，能觀察到癌癥之間突變數量和模式的變化(簽名A-E)。簽名A：主要特點是TpCpG三核苷酸序列上的C>T突變，也存在少量其他類型的突變。簽名B:主要特征是TpCpX三核苷酸序列上的C>T、C>G和C>A突變，主要發生在10%的ER+腫瘤樣本。簽名C:XpCpG三核苷酸序列上適量的C>T、C>G突變及少量的C>A突變。簽名D則表現出較均勻的分布。簽名E主要特點是TpCpX三核苷酸序列上的C>G突變，簽名E因此類似于簽名B，但缺乏簽名B中TpCpX三核苷酸序列上的C>T突變。該研究的主要發現是對病灶局部置換突變的檢測，即雷雨(kataegis)。雷雨特點是C>T和(或)C>G突變，主要發生在TpCpX三核苷酸序列的同一DNA鏈上。雷雨灶包括幾個到幾千個突變，主要發生基因組重排。雷雨簽名和簽名B可能與APOBEC家族(載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽家族)成員胞苷脫氨酶有關，在堿基切除修復和DNA復制機制的共同作用下，胞嘧啶轉換成尿嘧啶。隨后的大型研究，檢查了超過7 000個樣本30種不同類型的癌癥也表明APOBEC突變簽名富集在腫瘤細胞[17]。APOBEC家族成員加劇亞克隆擴張和瘤內異質性，這可能代表了一種新的靶向藥物，旨在限制腫瘤的演進、適應及耐藥。

3 解剖瘤內異質性

乳腺癌所有可識別的形態和功能特征均可呈現瘤內異質性，反映的是多克隆的存在。研究者通過基因組測序研究揭示了乳腺癌瘤內異質性(相同的腫瘤類型不同患者之間的分子差異)。他們通過估算在散發腫瘤內檢測到的突變事件的等位基因頻率也發現了空間的瘤內異質性(原發腫瘤的不同區域之間的分子差異)。時間的瘤內異質性描述了在疾病的進展過程中腫瘤的進化，它是腫瘤自然發展過程中的遺傳變異和抗癌治療過程中產生的選擇性壓力的組合。

時間的瘤內異質性最廣泛的研究形式涉及一個原發性乳腺癌及其相關的轉移性病變隨著時間的發展所產生的差異[17]。兩個開創性研究試圖通過深度測序理清這個問題[18-19]，Shah等[19]在一個原發乳腺小葉腫瘤并且9年后發生轉移的患者身上證實了基因組畸變的存在。小葉乳腺癌ER+亞型，雖然具有高轉移性，但可以在最初診斷后的許多年后復發，顯示出良好的預后[20]。這項研究揭示了32個基因發生體細胞非同義突變參與乳腺癌的轉移[19]，其中一些基因如CHD3、SP1、PALB2、ERBB2、USP28、klhl4、CDC6、kiaa1468、rnf220、COL1A1和SNX4在以前已被確定為乳腺癌的突變(但在不同的位置)，其余的在乳腺癌中首次被發現。32個基因中有11個也被發現在原發腫瘤中，而且11個中只有5個比較普遍，其余的則以較低的頻率出現，這意味著這些特定的基因突變被限制在亞克隆腫瘤細胞。這些數據有力地表明，在癌癥進展過程中發生了突變進化，然而目前還不清楚在乳腺癌轉移過程中是否腫瘤自然進化或化療的副作用會產生額外的突變。

基底樣乳腺癌具有侵襲性，并由于缺乏靶向治療，預后較差，往往遵循一個轉移過程，最終導致死亡[21]。目前，還不清楚侵襲性表型的轉移是否由最初發生在原發腫瘤的細胞突變驅動或由遷移到轉移部位后的腫瘤細胞突變驅動。在2010年發表的一項研究通過對新輔助治療一年后發生腦轉移的原發乳腺癌患者進行基因測序解決了這個問題[18]。原發性腫瘤最顯著的特點是突變的等位基因頻率范圍較寬，這意味著相當大的空間瘤內異質性。對于原發性腫瘤和轉移性腫瘤的時間異質性，研究者在轉移瘤中(并不出現在原發腫瘤)確定了2種從頭合成突變，20個共享點突變，1個重要的染色體重排涉及FBXW7基因1個大雜合子的缺失，這種基因編碼的蛋白質參與cyclin E和mTOR泛素介導的降解過程，如果這種功能缺失將導致染色體不穩定或腫瘤的發生[22]，此外CTNNA1基因水平雙等位基因的缺失將導致乳腺癌細胞失去細胞黏附[23]，并增加致瘤的特征[24]。

雖然二代測序技術使我們對瘤內異質性有了初步的認識，但有可能混雜了克隆多樣性，DNA和RNA的單細胞測序(SCS)方法為描述克隆多樣性和理解罕見細胞在癌癥進展的作用提供強大的新工具[25]。第一項研究使用這種技術結合流式細胞核技術，應用全基因組擴增和二代測序從三陰性乳腺癌個體細胞核內準確量化基因組拷貝數[26]。數據分析顯示，拷貝數畸變不時地爆發，其次是穩定的克隆擴張，最終形成腫瘤。在隨后的研究中，同一研究小組開發了一種新的測序方法，即核序列，應用于ER+浸潤性導管癌和三陰性乳腺癌患者，觀察腫瘤的突變景觀。這是一種高覆蓋、全外顯子組單細胞測序的方法[27]。從細胞群體和單細胞測序數據顯示三類的突變：(1)克隆突變，發現在總體樣本和大多數單一腫瘤細胞；(2)亞克隆突變，發現僅在單一腫瘤細胞；(3)從頭突變，發現僅在一類腫瘤細胞[27]。這些數據清楚地表明，即使在單細胞水平，也有著顯著的腫瘤異質性，而且不同腫瘤的亞克隆是隨著時間的推移積累不同的點突變的結果。

4 結 語

乳腺癌是一種異質性疾病，有著不同的組織學與病理學特征，具有復雜的分子生物學特征，具有多樣的遺傳與表觀遺傳突變，包括體細胞突變和DNA甲基化模式。二代測序技術臨床應用的意義在于識別疾病的分子亞型、腫瘤異質性以及確定新的治療靶點，為患者量身定制個體化治療方案，為此二代測序技術在乳腺癌的診斷、預后及治療中都起著著重要作用。下一步研究的重點將是通過二代測序技術為臨床醫生提供有用的和有效的信息進一步改善患者的預后水平。

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2016-03-01

2016-05-20

葉新星(1990-)，女，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。E-mail:290276584@qq.com

康欣梅 E-mail:kxm791107@163.com

葉新星，康欣梅.二代測序技術在乳腺癌分子生物學研究中的應用及進展[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(5)：813-816.

R737.9

A

1671-6264(2016)05-0813-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．038