獸用狂犬病疫苗的發(fā)展

馬曉莉　徐錚　劉忠華　陳嘉　余文蘭　華南農(nóng)業(yè)大學(xué)　510642

獸用狂犬病疫苗的發(fā)展

馬曉莉徐錚劉忠華陳嘉余文蘭華南農(nóng)業(yè)大學(xué)510642

狂犬病病毒只有一種血清型，世界各地的狂犬病毒抗原性質(zhì)是相同的。當(dāng)前大部分國(guó)家所用的獸用狂犬病疫苗主要有三種，即弱毒苗、滅活疫苗和基因工程疫苗。當(dāng)前我國(guó)獸用的有滅活苗和弱毒苗兩種，但是隨著生物和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新型狂犬病疫苗已經(jīng)逐漸走進(jìn)研究者的視野，例如多肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗及植物疫苗等。隨著獸用狂犬病疫苗的發(fā)展迅速，科學(xué)家們對(duì)其的研究也越來(lái)越深入，相信在不久的將來(lái)，狂犬病會(huì)得到很好的控制。

獸用；狂犬病疫苗；發(fā)展

1　神經(jīng)組織疫苗

最早制造狂犬病疫苗的是法國(guó)的巴斯德。1882年他成功地應(yīng)用連續(xù)傳代減弱病毒毒力的方法，用適應(yīng)毒種來(lái)制造疫苗。早期的狂犬病疫苗是用成年山羊和綿羊神經(jīng)組織經(jīng)石炭酸或石炭酸和乙醚滅活后制成，用于犬的免疫。但免疫后不僅引起神經(jīng)系統(tǒng)副反應(yīng)，而且疫苗中殘余的活毒能夠引起狂犬病。1955年，F(xiàn)uenja1ida和Pa1acios將狂犬病毒腦內(nèi)接種3～5日齡的新生鼠，于接種后4天收集腦組織，制備了新生鼠腦疫苗。由于新生鼠腦神經(jīng)組織中僅存在少量鞘磷脂，所以引發(fā)的副反應(yīng)較少。在過(guò)去的40多年里，南美洲廣泛使用此疫苗。由于神經(jīng)組織疫苗注射量大，接種次數(shù)多（14針以上），抗體產(chǎn)生慢、水平低，含有神經(jīng)麻痹因子，易引發(fā)變態(tài)反應(yīng)，而且疫苗中易殘留有感染性的活病毒，因此，WHO狂犬病專(zhuān)家委員會(huì)已提出盡快停止使用神經(jīng)組織疫苗。

2　雞胚疫苗

用雞胚生產(chǎn)狂犬病疫苗的毒株主要是F1ury和Ke1ev株。F1ury株為1939年分離自死于狂犬病名叫F1ury的女孩，經(jīng)1日齡雛雞腦內(nèi)傳了138代減毒，隨后又經(jīng)雞胚卵黃囊傳40～50代，取名F1ury雞胚株（F1ury LEP）。F1ury LEP對(duì)小白鼠、大白鼠和地鼠經(jīng)腦內(nèi)或肌肉途徑感染均有致病性，對(duì)豚鼠腦內(nèi)感染有致病性，肌肉感染則無(wú)致病力。F1ury LEP對(duì)家兔腦內(nèi)或肌肉均無(wú)致病性，對(duì)犬肌肉注射也沒(méi)有任何感染癥狀，但對(duì)貓和牛仍有致病性，因此認(rèn)為L(zhǎng)EP株對(duì)犬是安全的，被推薦僅供3月齡以上犬肌肉免疫用。LEP株進(jìn)一步傳代至138代稱(chēng)為L(zhǎng)EP高代雞胚株（F1uryHEP），其毒力進(jìn)一步減弱，但對(duì)乳鼠腦內(nèi)接種仍有致病性，被推薦用于犬、貓和牛的肌肉免疫。Ke1ev株為1950年分離自以色列的一只患狂犬病的犬經(jīng)雞胚傳100代減毒，對(duì)地鼠、豚鼠和家兔肌肉和腦內(nèi)接種均未感染。用高濃度病毒懸液肌肉接種犬未產(chǎn)生任何感染癥狀，用于制備疫苗的毒種為60～70代雞胚株，已被推薦用于犬和牛的肌肉注射。

3　獸用弱毒口服疫苗

弱毒活疫苗是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)，所用毒株主要包括 Street A1abama Dufferin（SAD）株、Eve1yn-Rokitnicki-Abe1seth（ERA）株及其他SAD株相關(guān)毒株。與滅活疫苗相比，弱毒活疫苗的生產(chǎn)成本低廉，主要是由于弱毒疫苗株RV能在動(dòng)物體內(nèi)增殖、合成病毒抗原，能以較少的病毒量誘導(dǎo)有效地保護(hù)性免疫反應(yīng)，降低了狂犬病疫苗的生產(chǎn)成本，因而在亞洲、非洲和歐洲部分地區(qū)仍被使用。盡管弱毒活疫苗價(jià)格比滅活疫苗低廉，而且可以通過(guò)口服途徑免疫接種，然而弱毒活疫苗存在一個(gè)致命缺陷：病毒在動(dòng)物體內(nèi)增殖時(shí)，其殘留毒力或致病性突變有時(shí)會(huì)致使接種動(dòng)物發(fā)病。世界衛(wèi)生組織不推介弱毒活疫苗經(jīng)非口服途徑免疫接種動(dòng)物，現(xiàn)在主要用于動(dòng)物的口服免疫。因此，現(xiàn)在滅活疫苗比弱毒活疫苗的使用范圍更為廣泛。

4　基因工程疫苗

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們開(kāi)始研究狂犬病病毒重組活疫苗，目的在于保留狂犬病病毒有免疫原性的抗原部分，而不含狂犬病病毒的致病性，降低組織培養(yǎng)的生產(chǎn)成本。狂犬病病毒中可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原為糖蛋白（G），具有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的保護(hù)性抗原為核蛋白 （N）。近幾年對(duì)狂犬病病毒G和N基因表達(dá)及免疫效果進(jìn)行了研究，主要為口服免疫有效的重組體。1984年美國(guó) Wistar研究所和法國(guó)Trangen合作研究，由Kieny等合成了一種新疫苗，用牛痘病毒加入狂犬病毒的糖蛋白抗原基因，稱(chēng)為VRG （Vaccinia Rabies G1ycoprotein）。VRG的主要步驟是先克隆G基因的cDNA，經(jīng)修飾后拼接啟動(dòng)子及痘病毒的TK基因構(gòu)成載體，再與感染痘病毒的細(xì)胞進(jìn)行重組。再經(jīng)空斑克隆3次純化后，經(jīng)Southemb1ot、免疫熒光、免疫印染等證實(shí)表達(dá)的糖蛋白分子量為66kD，與天然糖蛋白相同。可在Vero細(xì)胞系上培養(yǎng)。VRG口服疫苗于1987年10月24日在比利時(shí)進(jìn)行投放，共投放了250個(gè)誘餌。對(duì)實(shí)驗(yàn)中心地區(qū)238個(gè)誘餌進(jìn)行觀察，在投放后94%的誘餌被吃掉。溫度在-10～20℃的條件下，VRG保存 90天沒(méi)有明顯的滴度變化，只有在4個(gè)月時(shí)發(fā)生下降。由此可見(jiàn)VRG株VI服疫苗具備有效性、無(wú)毒性和熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)。1989年加拿大Prevec等將狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因cDNA重組到人腺病毒5型基因組中，獲得重組體HAd5RG，臭鼬口服HAd5RG后，保護(hù)率100%基因重組口服疫苗比現(xiàn)行活疫苗更安全、更便于生產(chǎn)，而且成本低，使用方便。

國(guó)內(nèi)有研究在狂犬病毒弱毒株Hep-F1ury株全基因組3'-N-P-M-G-L-5'的偽基因區(qū)域（G與L之間），插入一個(gè)G基因，構(gòu)建了攜帶雙G基因的全長(zhǎng)感染性克隆，其與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功獲得狂犬病毒Hep-F1ury-dG嵌合病毒，盲傳十代，用熒光抗體和RT-PCR鑒定，該嵌合病毒在BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定生長(zhǎng)。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，結(jié)果表明，Hep-F1ury-dG株和rHep-F1ury株比較，其致病性降低、免疫原性提高。國(guó)內(nèi)研究者在廣州市增城區(qū)某村進(jìn)行狂犬病基因工程滅活疫苗（Hep-F1ury-dG株）環(huán)境釋放試驗(yàn)，登記該村所有家養(yǎng)犬的信息并存檔，同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫。隨機(jī)采集免疫前血清樣品66份，免疫后21天獲得血清樣品66份，使用ELISA方法檢測(cè)樣品的抗體水平。發(fā)現(xiàn)免疫前該村犬只抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為26%，免疫后21天抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到83%。統(tǒng)計(jì)分析表明，免疫前后抗體水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此得出結(jié)論，狂犬病基因工程滅活疫苗（Hep-F1ury-dG株）免疫犬只后可提供足夠的保護(hù)力，有效保護(hù)犬只免受狂犬病病毒感染，因而預(yù)防狂犬病從犬-犬或犬-人的傳播。為農(nóng)村地區(qū)家養(yǎng)犬建立免疫檔案，監(jiān)控犬只抗體水平，使犬群間形成狂犬病抗體陽(yáng)性率達(dá)到70%以上的堅(jiān)強(qiáng)免疫帶，是預(yù)防農(nóng)村地區(qū)狂犬病發(fā)生的一種可行、有效的方法。

（1）基因重組減毒疫苗。20世紀(jì)80年代，狂犬病病毒糖蛋白基因克隆和測(cè)序不久后，便開(kāi)始制備異源性重組狂犬病疫苗研究。狂犬病毒重組疫苗是指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，借助載體對(duì)狂犬病毒中的基因進(jìn)行重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物或重組體本身用于研制疫苗。由于重組體只保留了狂犬病毒中具有免疫作用的基因，因此這種疫苗不具有發(fā)生狂犬病的潛在危險(xiǎn)。重組疫苗的載體有大腸桿菌、痘苗病毒腺病毒、桿狀病毒、犬皰疹病毒和非復(fù)制病毒載體等。有學(xué)者就曾通過(guò)基因敲除使RV的磷酸化蛋白基因缺失，構(gòu)建重組RV活疫苗。這種疫苗與傳統(tǒng)的減毒活苗相比，也可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)性抗體。但是基因重組減毒疫苗也存在著潛在的危險(xiǎn)，比如基因突變的減毒活疫苗會(huì)與自然存在的野毒株發(fā)生重組，或者原本敲除的基因會(huì)重新發(fā)生基因修補(bǔ)，從而出現(xiàn)毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象。

（2）核酸疫苗。也叫DNA疫苗，是將編碼某種抗原蛋白的基因置于真核表達(dá)元件的控制之下，構(gòu)成重組質(zhì)粒DNA，將其直接導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。基因疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫，能夠刺激產(chǎn)生較強(qiáng)和較持久的免疫應(yīng)答，可以將含有不同抗原基因的質(zhì)粒混合起來(lái)進(jìn)行聯(lián)合免疫，能夠反復(fù)使用，因此基因疫苗成為新型疫苗發(fā)展的熱點(diǎn)。第一個(gè)報(bào)道的狂犬病核酸疫苗是攜帶和表達(dá)ERA株糖蛋白eDNA的重組質(zhì)粒。1994年Wistar研究所Xiang ZQ等將編碼狂犬病病毒糖蛋白的eDNA插入SV40啟動(dòng)子下游，構(gòu)建狂犬病病毒的DNA疫苗，直接注射小鼠腓腸肌，免疫3次，間隔2～3周，150g/次。免疫后小鼠產(chǎn)生了抗狂犬病病毒中和抗體、抗狂犬病病毒糖蛋白特異性CTL和分泌淋巴因子的rrh細(xì)胞，用5倍LD50劑量的狂犬病病毒CVS株攻擊，均獲得保護(hù)，而對(duì)照組小鼠14天內(nèi)全部死亡。Lodme11 D L等把帶有G基因的DNA包被在2.6in金粒上，用基因槍免疫小鼠，初免及加強(qiáng)免疫后均可檢測(cè)高滴度的抗體，并持續(xù)300天，315天后用致死量的狂犬病病毒攻擊，小鼠全部存活。Ray N B等用單磷脂質(zhì)A作為免疫刺激物，皮下免疫小鼠，可以提高DNA疫苗的免疫應(yīng)答。國(guó)內(nèi)扈榮良等首先將狂犬病病毒糖蛋白G基因插入PMTOIO/A+表達(dá)載體中，肌肉免疫小鼠后，能產(chǎn)生抗狂犬病病毒的抗體，對(duì)狂犬病病毒強(qiáng)毒攻擊有一定的保護(hù)作用。李萍等將狂犬病病毒G基因重組到質(zhì)粒PRC/CMV中，免疫小鼠可產(chǎn)生低滴度的中和抗體，對(duì)狂犬病病毒強(qiáng)毒攻擊有一定的保護(hù)作用。基因疫苗雖然有眾多優(yōu)勢(shì)，但是基因疫苗可能存在的安全性問(wèn)題是外源基因?qū)塍w內(nèi)后，可能與細(xì)胞染色體基因組發(fā)生整合，從而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌變，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)有整合的證據(jù)。

捕殺流浪犬，加強(qiáng)家犬管理和強(qiáng)制接種狂犬病疫苗，預(yù)防家畜及野生動(dòng)物的狂犬病是預(yù)防人感染狂犬病的重要措施，其任務(wù)涉及面廣，需要全社會(huì)的配合、支持與理解。

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