微生物生產L-蘇氨酸的代謝工程研究進展

董迅衍， 王小元*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

微生物生產L-蘇氨酸的代謝工程研究進展

董迅衍1，2， 王小元*1，2

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

L-蘇氨酸作為一種必需氨基酸被廣泛用于食品、飼料、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)。目前L-蘇氨酸主要通過微生物發(fā)酵法生產。代謝工程技術的應用為菌種選育開辟了有效途徑，使在現(xiàn)有高產基礎上進一步提高氨基酸的產量成為可能。作者對兩大氨基酸生產菌——大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的L-蘇氨酸生物合成相關途徑、代謝調控機理以及運用代謝工程技術提高L-蘇氨酸產量所取得的成果進行了系統(tǒng)綜述。

L-蘇氨酸；谷氨酸棒桿菌；大腸桿菌；代謝工程；發(fā)酵

氨基酸發(fā)酵產業(yè)規(guī)模在過去10年中整整擴大了一倍，目前達到了500萬t/年。大腸肝菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）及其亞種是發(fā)酵法生產氨基酸的主力軍。其中，由微生物發(fā)酵法生產、年產量排名前三的分別是L-谷氨酸（220萬t）、L-賴氨酸（195萬t）和L-蘇氨酸（33萬t）[1-2]。如圖1所示，由1993年的0.4萬t/年到2014年的330萬t/年，L-蘇氨酸的世界年產量提高了82倍。目前，全球L-蘇氨酸以每年超20%的增長率高速增長，這主要是因為L-蘇氨酸在飼料添加劑行業(yè)的需求量增長迅速。近年來的研究表明，作為8種必需氨基酸之一，L-蘇氨酸是豬飼料的第二限制氨基酸和家禽飼料的第三限制氨基酸。以添加了蘇氨酸的低蛋白配方飼料作為家禽日糧，不但降低了飼喂成本，還有利于家禽吸收，可促進家禽的生長[3]。除了可以緩解天然蛋白質的匱乏，家禽飼料營養(yǎng)配比合理還可以有效減少動物氨的排放，從而減少環(huán)境污染，有利于社會的可持續(xù)發(fā)展。此外，L-蘇氨酸在食品、醫(yī)藥和化妝品等領域的用量也呈長期穩(wěn)定增長趨勢。在食品領域，L-蘇氨酸是各類氨基酸保健飲品的配方成分，也是重要的食品強化劑，可以與其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，還可以與葡萄糖共熱產生焦香味。在醫(yī)藥領域，L-蘇氨酸有促進人體生長發(fā)育、促進骨髓T淋巴細胞前體分化發(fā)育成為成熟T淋巴細胞和抗脂肪肝的藥用療效，因此在臨床方面有著廣泛的應用。此外，L-蘇氨酸還是制造高效低過敏的抗生素單酰胺菌素等藥物的中間體。在化妝品領域，L-蘇氨酸的分子具有羥基結構，因此可用作保濕劑[4]。

圖1 L-蘇氨酸世界年產量Fig.1 L-threonine world annual yield

1 L-蘇氨酸的生物合成途徑

L-蘇氨酸的生物合成以TCA循環(huán)中間代謝物草酰乙酸為前體。底物葡萄糖代謝經過糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)及C3-C4回補途徑等中心代謝途徑，由草酰乙酸經天冬氨酸轉氨酶催化生成L-天冬氨酸，即進入L-蘇氨酸合成途徑，見圖2。此轉氨反應中，由L-谷氨酸提供氨基基團。其中，C3-C4回補途徑是指在磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸-草酰乙酸節(jié)點處發(fā)生的C3化合物的羧化反應以及C4化合物的脫羧反應。由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（PC）分別催化的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的羧化反應，直接生成草酰乙酸；而由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化的草酰乙酸和蘋果酸的脫羧反應，則直接消耗掉草酰乙酸。在E.coli和C.glutamicum中，PEPC、PEPCK和PC均分別由ppc、pck和pyc基因編碼[5]。

由L-天冬氨酸起，L-蘇氨酸途徑包含5步酶催化反應：1）天冬氨酸激酶（AK），催化L-天冬氨酸γ-羧基磷酸化生成磷酰天冬氨酸；2）天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD）以NADPH為還原力，催化磷酰天冬氨酸還原生成天冬氨酸半醛；3）高絲氨酸脫氫酶（HD）以NADPH為還原力，催化天冬氨酸半醛脫羧生成L-高絲氨酸；4）高絲氨酸激酶（HK），催化L-高絲氨酸磷酸化，生成磷酰高絲氨酸；5）蘇氨酸合酶（TS）催化磷酰高絲氨酸脫磷酸基團，生成L-蘇氨酸。在E.coli中，AK有三種同工酶，分別為AKI、AKII和AKIII[14-15]；HD有兩種同工酶，分別為HDI和HDII。AKI和HDI組成雙功能酶，由thrA基因編碼；AKII和HDII組成雙功能酶，由metL基因編碼[8]；單功能的AKIII則由lysC基因編碼[17]。在3種EcAK中，EcAKI的蛋白質豐度最高，而EcAKII的蛋白質豐度最低。EcASD、EcHK和EcTS則均為單一酶，分別由 asd、thrB和 thrC基因編碼[18-19]。在C.glutamicum中，上述5種酶均不存在同工酶：AK由lysC基因編碼[10]；ASD由asd基因編碼[9]；HD由hom基因編碼[10]；HK由thrB基因編碼[10]；TS由thrC基因編碼[10]。L-蘇氨酸由胞內向胞外轉運被認為是微生物發(fā)酵生產L-蘇氨酸的限速步驟。在E.coli中，有3種L-蘇氨酸輸出蛋白質：RhtA、RhtB和RhtC，分別由rhtA、rhtB和rhtC基因編碼[11-12]。在C. glutamicum中，目前僅發(fā)現(xiàn)1種L-蘇氨酸輸出蛋白ThrE，由thrE基因編碼[26-27]。

圖2 L-蘇氨酸生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of L-threonine

對于L-蘇氨酸生物合成而言，碳流的浪費主要是由以下4條途徑造成：1）其合成途徑上的L-賴氨酸旁支路途徑；2）L-甲硫氨酸旁支路途徑；3）其合成后在胞內被降解為甘氨酸；4）用于合成L-異亮氨酸。L-賴氨酸旁支路途徑在E.coli和C.glutamicum中都是由dapA基因編碼的二氫吡啶二羧酸合酶（DDPS）催化起始[15]。L-甲硫氨酸旁支路途徑在E.coli中則由metA基因編碼的琥珀?；D移酶（SCT）催化起始[16]；在 C.glutamicum中則由metX基因編碼的乙?；D移酶（ACT）催化起始。需要特別說明的是，在C.glutamicum中，分別存在2條L-賴氨酸合成途徑（split pathway，在二氫吡啶二羧酸節(jié)點處分裂成兩條途徑）[17]和2條L-甲硫氨酸合成途徑 （在氧乙酰高絲氨酸節(jié)點處分裂成兩條途徑）[18]。L-蘇氨酸降解成甘氨酸的途徑L-蘇氨酸降解生成甘氨酸的途徑在E.coli中有兩條，分別由tdh基因[19]編碼的蘇氨酸脫氫酶（TDH）和ltaE基因[20]編碼的蘇氨酸醛縮酶（TA）催化起始；而在C.glutamicum中目前只發(fā)現(xiàn)了一條，是由glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMT）催化一步生成。

2 L-蘇氨酸生物合成調控機制

在E.coli中，L-蘇氨酸合成途徑上所有基因的轉錄都受終端產物的反饋阻遏調控：thrA、thrB和thrC基因的轉錄受L-蘇氨酸和L-異亮氨酸協(xié)同反饋阻遏調控；metL基因的轉錄受L-甲硫氨酸反饋阻遏調控；lysC基因的轉錄受L-賴氨酸反饋阻遏調控；asd基因的轉錄受L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸共價反饋阻遏調控[21]。其中，thrA、thrB和thrC基因在染色體上組成thrABC操縱子[22]。在thrA基因可讀編碼框上游存在一段178 bp長度的前導序列thrL。L-蘇氨酸和L-異亮氨酸對這三個基因的轉錄調控由thrL介導的轉錄衰減機制實現(xiàn)。在thrA基因上游37個堿基位點處插入一個G堿基可解除該轉錄衰減調控[23-24]。L-賴氨酸對lysC基因轉錄的調控則由其上游的前導序列介導的翻譯衰減機制實現(xiàn)[25]。而在酶活水平上，EcAKI-EcHDI、EcAKIII、EcHK受終端產物反饋抑制調節(jié)。EcAKI的活性受L-蘇氨酸不完全反饋抑制調節(jié)。L-蘇氨酸既可通過改變EcAKI的構象，又可通過與底物L-天冬氨酸競爭結合位點抑制其活性。EcHDI的活性同樣也受L-蘇氨酸不完全反饋抑制調節(jié)，但抑制機制為非競爭性[6]。L-賴氨酸可以通過改變EcAKIII的構象而完全抑制其活性[26-27]。定點突變T344M、S345L及T352I均可部分解除EcAKIII受L-賴氨酸的抑制[27]。EcHK受反饋抑制情況較為復雜。它不但受終端產物L-蘇氨酸的競爭性反饋抑制及L-賴氨酸的非競爭性反饋抑制，還受底物L-高絲氨酸（濃度高于1 mmol/L時）和ATP（濃度高于3 mmol/L時）的抑制調節(jié)[6]。

在C.glutamicum中，L-蘇氨酸合成途徑上只有hom和thrB兩個基因的轉錄受L-甲硫氨酸反饋阻遏調節(jié)。這兩個基因在染色體上按5’hom-thrB 3’方向組成一個操縱子。該操縱子5’端上游有一長串反向重復序列，預示存在衰減子作用，與hom和thrB的轉錄受L-甲硫氨酸反饋阻遏調節(jié)有關[28]。而在酶活水平上，CgAK、CgHD和CgHK三個酶的活性受終端產物的反饋抑制調節(jié)。CgAK是變構調節(jié)酶，其活性受終產物L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制調節(jié)。多個CgAK編碼基因上的突變位點均可完全解除該反饋抑制[29]。CgHD的活性受L-蘇氨酸反饋抑制調節(jié)。L-蘇氨酸的結合單元位于CgHD的C-端[30]。2 mmol/L L-蘇氨酸即可完全抑制野生型CgHD的活性。Dieter等通過對hom基因進行G1133A單堿基突變得到的CgHDG378E突變體在25 mmol/L L-蘇氨酸存在時完全不受抑制；且半抑制L-蘇氨酸濃度高達100 mmol/L[31]。CgHK的活性略受L-蘇氨酸反饋抑制調節(jié)。酶學動力學實驗結果表明，L-蘇氨酸對此酶的抑制作用系競爭性抑制：隨著其底物L-高絲氨酸濃度提高，受抑制程度降低。野生型CgHK的半抑制L-蘇氨酸濃度為25 mmol/L[32]?；诟偁幮砸种茩C制——底物與抑制物結合位點為同一個，抑制的解除不能通過改變酶蛋白結構來實現(xiàn)，而只能依靠提高底物L-高絲氨酸的濃度來緩解[33]。

3 L-蘇氨酸生產菌代謝工程研究狀況

L-蘇氨酸生產菌構建過程中采用的代謝工程策略主要有：1）高效表達合成途徑關鍵酶基因，以提高合成途徑碳流量；2）削弱競爭支路的碳流量，以聚攏碳流，同時減少副產物的合成；3）削弱L-蘇氨酸的胞內降解；4）加快L-蘇氨酸向胞外分泌，以減少L-蘇氨酸的胞內降解及避免胞內產物濃度積累過高而抑制關鍵酶的催化活性。

3.1 加強L-蘇氨酸合成途徑關鍵基因的表達

高效表達合成途徑關鍵酶的編碼基因，尤其是抗反饋抑制的突變體基因，可以有效地提高L-蘇氨酸產量。在E.coli中，高效表達thrABC操縱子是最常用的策略。Livshits等[11]在L-蘇氨酸生產菌E.coli MG442中通過用質粒載體表達帶有突變位點的thrA442BC操縱子，將L-蘇氨酸產量由8 g/L提高到18.4 g/L。張雪等在野生型菌株E.coli W3110中通過用高拷貝質粒載體pMD19-T表達thrA345BC操縱子實現(xiàn)了 9.2 g/L L-蘇氨酸胞外積累[34]。在C.glutamicum中，高效表達lysC，hom和thrB這三個關鍵基因被證實對提高L-蘇氨酸合成有利。Eikmanns等[35]在 C.glutamicum DM368-3（AECr，AHVr）中通過采用質粒載體高效表達homr-thrB操縱子，將L-蘇氨酸產量由6.3 mmol/L提高至14.1 mmol/L。Colon等[32]通過在 L-賴氨酸生產菌C.lactofermentum ATCC21799（AECr）中用質粒載體組成型高效表達homr，同時誘導型高效表達thrB，實現(xiàn)L-蘇氨酸胞外積累達11.8 g/L，而原產物L-賴氨酸的產量由22.0 g/L降至0.8 g/L。

3.2 加強L-蘇氨酸向胞外分泌

當L-蘇氨酸積累達到一定濃度時，其由胞內向胞外的轉運成為生產的限速步驟。高濃度的胞內L-蘇氨酸積累會抑制合成途徑關鍵酶的催化活性，增加降解代謝產物的合成，甚至抑制細胞生長。因此，加強L-蘇氨酸向胞外分泌是非常有效的代謝工程策略。Kruse等[12]在E.coli MG422中通過用質粒載體分別表達內源的rhtB、rhtC和來自C.glutamicum的thrE，將L-蘇氨酸產量分別提高了1.4倍、2倍和2.9倍。Livshits等[11]在E.coli MG422（pAYC32-thrArBC）菌株中通過對染色體上rhtA基因起始密碼子上游1個堿基進行G→A替換突變以加強其轉錄，將L-蘇氨酸產量由18.4 g/L提高到36.3 g/L。Simic等[36]通過在L-蘇氨酸生產菌C.glutamicum DR-17中用質粒載體表達內源的thrE基因，將L-蘇氨酸產量由5.8 g/L提高到了8.1 g/L。Diesveld等[37]通過在C.glutamicum DM368-3（AECr，AHVr）中用質粒載體異源表達來自E.coli的rhtC基因，將L-蘇氨酸產量由0.9 g/L提高到了3.7 g/L，并將副產物甘氨酸的產量由1.1 g/L降低至0.15 g/L。

3.3 削弱L-蘇氨酸在胞內的消耗

L-蘇氨酸發(fā)酵生產的過程中主要產生的副產物有L-甘氨酸、L-異亮氨酸和L-賴氨酸，其中前兩者為L-蘇氨酸胞內降解代謝產物。由于轉運蛋白和降解代謝途徑之間相互競爭共同底物L-蘇氨酸，因此，減少胞內消耗損失可提高L-蘇氨酸產量，還可以減少副產物的產生，從而降低下游提取成本。Lee等[38]在一株E.coli L-蘇氨酸生產菌中通過對染色體上ilvA基因進行C290T突變以降低其編碼的TD的催化活性，并通過敲除染色體上的tdh基因以減少 L-蘇氨酸胞內消耗。Diesveld等[24]在 C. glutamicum DM1800-T中通過對染色體上ilvA基因進行定點突變使其編碼的TD失活，將L-蘇氨酸產量由2.5 g/L提高到4 g/L。

3.4 系統(tǒng)代謝工程

系統(tǒng)代謝工程技術的應用給L-蘇氨酸生產菌的構建帶來了突破性的進展。通過系統(tǒng)代謝工程改造，研究人員成功構建出了幾株E.coli L-蘇氨酸高產菌株。最典型的案例是由Lee等[72]從野生型的E.coli W3110構建出高產 L-蘇氨酸的 TH28C（pBRThrABCR3）。他們首先將E.coli W3110染色體上的lacI基因敲除，使一些強啟動子如Ptac和Ptrc可以進行組成型轉錄。其次，通過三步改造來加強L-蘇氨酸合成途徑：1）對染色體上thrA和lysC基因分別進行C1034T和C1055T定點突變，以解除AKI和 AKIII的反饋抑制調節(jié)；2）將染色體上thrABC操縱子的啟動子替換成Ptac啟動子，以解除反饋阻遏調節(jié)；3）將解反饋抑制的thrABC操縱子放到質粒載體上過表達。接著，通過削弱競爭支路途徑及L-蘇氨酸降解代謝途徑來減少副產物并聚攏碳流：1）敲除染色體上的lysA基因（編碼L-賴氨酸合成途徑上最后一個酶）以阻斷L-賴氨酸的合成；2）敲除染色體上的metX基因以阻斷L-甲硫氨酸支路；3）敲除染色體上的tdh基因減少L-蘇氨酸向甘氨酸的轉化；4）通過對染色體上ilvA基因進行C290T突變以降低TD的催化活性，從而減少L-蘇氨酸向L-異亮氨酸的轉化。隨后，通過加強前體草酰乙酸的供應來提高L-蘇氨酸產量：1）將染色體上ppc基因的啟動子替換成Ptrc啟動子以加強其轉錄；2）敲除染色體上編碼異檸檬酸裂合酶和蘋果酸合酶的阻遏蛋白的iclR基因，以加強乙醛酸循環(huán)。再者，通過敲除L-蘇氨酸吸收轉運蛋白基因tdcC以及用質粒載體過表達rhtA、rhtB和rhtC基因來加強L-蘇氨酸的分泌。最后，通過將染色體上乙酰輔酶A合酶編碼基因acs的啟動子替換成Ptrc啟動子以加強其轉錄，從而減少乙酸的積累。最終構建得到的菌株TH28C（pBRThrABCR3）在罐上分批補料發(fā)酵50 h可生產82.4 g/L L-蘇氨酸。L-蘇氨酸-葡萄糖轉化率達到39.3%。并且不積累L-乳酸，僅積累2.35 g/L乙酸，見圖3。

另一個典型案例是Lee等[39]從基因組精簡的E.coli MDS42出發(fā)構建出一株不含游離質粒的L-蘇氨酸高產菌MDS-205。在MDS-205中，染色體上thrABC操縱子的啟動子被Ptac啟動子替換，而lacI、tdh基因被敲除；L-蘇氨酸吸收蛋白基因tdcC和sstT被突變型L-蘇氨酸分泌蛋白基因rhtA23所替換。MDS-205在罐上發(fā)酵30 h可生產40.1 g/L L-蘇氨酸，糖酸轉化率達到39.3%。該菌最大的特點是細胞生長強勁，尤其適合高密度細胞培養(yǎng)，可縮短發(fā)酵周期。

4 展望

隨著市場需求量的不斷加大，L-蘇氨酸產業(yè)優(yōu)化需要進一步提高產量、降低成本。我國L-蘇氨酸生產起步較晚，21世紀初主要依靠進口，近幾年雖然自主生產發(fā)展迅速，但是，我國飼料產業(yè)對L-蘇氨酸的需求量進一步加大。隨著人們保健意識的加強以及L-蘇氨酸作為藥物中間體等新價值的開發(fā)，L-蘇氨酸在醫(yī)藥行業(yè)的應用越來越廣。因此，構建L-蘇氨酸高產菌對社會發(fā)展及國民經濟具有重要意義。目前工業(yè)上發(fā)酵生產L-蘇氨酸普遍采用E. coli菌株。其優(yōu)點是生長迅速，發(fā)酵周期短，產量高。而在工業(yè)上產量排名前三（發(fā)酵法生產）的氨基酸中，除了L-蘇氨酸，L-谷氨酸和L-賴氨酸均采用C. glutamicum發(fā)酵生產。C.glutamicum是非致病的格蘭氏陽性菌，符合食品安全標準，不生芽孢，并且生長也較快，被普遍認為是氨基酸發(fā)酵生產的理想菌種。然而C.glutamicum的L-蘇氨酸合成能力在過去20年中始終未獲得突破性的提高——L-蘇氨酸產量和糖酸轉化率都遠低于E.coli。作者所在團隊從開發(fā)適用于C.glutamicum的分子操作工具（如基因表達和敲除載體）入手[40-43]，致力于C.glutamicum的氨基酸代謝工程研究[44-47]，對C.glutamicum的L-蘇氨酸合成能力仍在挖掘中[48-50]。目前微生物發(fā)酵生產L-蘇氨酸的糖酸轉化率僅為40%~50%，與理論最大轉化率81%相比[38]，還有很大提升空間。運用代謝工程技術構建生產菌相對于傳統(tǒng)育種的優(yōu)點是可以大大縮短菌種選育的周期。此外，由于構建出的菌株遺傳背景明確，后期發(fā)酵優(yōu)化過程將可相應得到簡化。

圖3 L-蘇氨酸生產菌的代謝工程優(yōu)化Fig.3 Metabolic engineering of L-threonine production strains

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Advances in Microbial Metabolic Engineering to Increase L-Threonine Production

DONG Xunyan1，2， WANG Xiaoyuan*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

As an essential amino acid for mammals，L-threonine has a wide application in the food，feeds，pharmaceutical and cosmetics industries.To date，L-threonine is almost exclusively produced through microbial fermentation.Metabolic engineering provides an effective means to strain development and thus to enhancing the L-threonine production.In this article，the pathway and regulation of L-threonine in the major industrial strains，Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are summarized，and advances on metabolic engineering to increase L-threonine production are reviewed.

L-threonine，Corynebacterium glutamicum，Escherichia coli，metabolic engineering，fermentation

Q 933

A

1673—1689（2016）12—1233—08

2016-07-08

國家973計劃項目（2012CB725202）；國家自然科學基金項目（NSFC31370131）；江南大學博士科研基金項目（JUDCF11025）。作者簡介：董迅衍（1986—），女，江蘇無錫人，發(fā)酵工程博士研究生，主要從事氨基酸生產菌株代謝工程方面的研究。Email：xunyandong@gmail.com

*通信作者：王小元（1965—），男，山西垣曲人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業(yè)微生物代謝工程方面的研究。E-mail：xwang@jiangnan.edu.cn