中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達鑒定

曹 雪， 陳占寬， 白仲虎， 楊艷坤*， 陳繼峰

（1．鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2．糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；3.河南天茂生物有限公司，河南 鄭州450001）

中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達鑒定

曹 雪1，2， 陳占寬3， 白仲虎2， 楊艷坤*2， 陳繼峰1

（1．鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2．糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；3.河南天茂生物有限公司，河南 鄭州450001）

有機磷污染是食品安全的重大隱患，乙酰膽堿酯酶（Acetyl cholinesterase，AChE）可用于有機磷農藥殘留的檢測。中華蜜蜂是我國獨有的蜜蜂當家品種，蜜蜂對農藥的敏感性很高，中華蜜蜂來源的乙酰膽堿酯酶基因尚未被克隆并應用于食品安全監測。以中華蜜蜂頭部組織總RNA為模板，經RACE方法獲得了AChE基因cDNA全序列，全長約1.8 kb。構建重組表達載體pPIC3.5K-AChE，將目的基因表達盒整合入畢赤酵母GS115的基因組中獲得重組菌株，0.5%甲醇誘導重組菌株表達AChE蛋白，經SDS-PAGE、酶活性分析表明，中華蜜蜂AChE基因首次克隆成功并首次在畢赤酵母中獲得成功表達，篩選出一株酶活性較高的菌株，純化的重組乙酰膽堿酯酶其活性為10 568 U/mg，可以用于有機磷農藥殘留的檢測。

食品安全；有機磷檢測；中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶；巴斯德畢赤酵母；克隆表達

近年來，隨著經濟的發展，人們生活水平逐漸提高，越來越多的消費者對食品的安全、營養等方面的要求的不斷提高。重視食品安全，已經成為衡量人民生活質量、社會管理水平和國家法制建設的一個重要方面[1]。為食品安全定義一個切實有效的標準是當前食品安全工作的重中之重，而食品中農藥殘留的檢測是判斷食品安全與否的一個重要指標。

農藥能夠防治病蟲害、去除雜草、控制人畜傳染病、提高農產品的產量和質量，其發明和使用大大提高了農作物的產量，但農藥的大量及不合理使用使食品中的農藥殘留對人類健康造成的負面影響也日益顯露出來[2-4]。農藥殘留對食品安全構成的威脅就是農殘超標[5]。近年來，由于農產品中高毒農藥殘量超標造成的中毒事故屢有發生[6]，研究證實，農藥對人體有致畸致癌的作用，因此做好農藥殘留檢測的工作就成了重中之重。

快速檢測技術是目前的農藥殘留檢測的主要方法之一，原理是有機磷和氨基甲酸酯類農藥能抑制昆蟲神經系統中乙酰膽堿酯酶的活性，造成神經傳導介質乙酰膽堿積累，影響正常傳導，使昆蟲中毒致死。這一毒理學原理也用于農藥殘留的檢測中[7]。近年來，已有公司研制出農藥殘留檢測儀器和試紙，但這些產品使用的酶原料主要來自生物體的蛋白質提取液，存在很多雜蛋白質，很大程度上影響了檢測結果的準確性和重復性且酶原料的量受限于生物體的數量，這些問題極大地限制了這些產品的大量推廣應用。

中華蜜蜂是我國獨有的蜜蜂當家品種，近年來因農藥中毒導致蜜蜂死亡的現象遍及全球，中華蜜蜂對農藥的靈敏度很強[8]。自20世紀以來我國雖已開展了中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶對農藥敏感度的研究工作[8-9]，但至今未見關于中華蜜蜂AChE用于農藥殘留檢測的報道，也未發現任何有關于利用基因工程技術在外源蛋白質表達系統中表達中華蜜蜂AChE的文獻與專利的報道。當前雖已開展了多種生物來源的乙酰膽堿酯酶的研究[10-13]，但其在農藥殘留檢測方面的應用并不是最優的，有必要研究出一種更有效更靈敏的酶源。

作者根據中華蜜蜂的獨有特征鑒定得到中華蜜蜂。并在研究前期通過RACE方法獲得了中華蜜蜂AChE基因的cDNA全序列，與GeneBank中查到的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶部分基因序列片段同源對比相似性達到99%，與意大利蜜蜂的相似性達到了94%。取中華蜜蜂頭部組織總RNA經RT-PCR技術獲得AChE基因cDNA全序列并構建畢赤酵母表達載體pPIC3.5K-AChE，轉化入畢赤酵母GS115進行表達，探索分析重組AChE的性質，為其在農藥殘留檢測方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

電擊杯與電轉儀：BIO-RAD公司；PCR儀：美國應用生物公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；臺式高速離心機：HITCHI；電子分析天平：梅特勒-托利多儀器；凝膠成像系統：BIO-RAD；蛋白質電泳儀：北京六一儀器廠；G560E型振蕩儀：Scientific Industries。

1.2 主要試劑和培養基

1.2.1 主 要 試 劑 逆 轉 錄 酶 （Reverse Transcriptase），PCR高保真酶 （LA Taq）：TaKaRa公司；SnaBⅠ、NotⅠ和SalⅠ：Thermo公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒：Axygen公司；山梨糖醇（sorbitol）、遺傳霉素（G418）：北京索來寶公司；3-吲哚乙酰酯（3-indoxyl acetate）：TCI公司；海貍磁珠純化試劑盒：海貍生物科技有限公司；ZYD-NYM-500型農藥檢測試劑盒：北京智云達科技有限公司。

1.2.2 主要培養基的配制

1）LB培養基（g/dL）：酵母膏0.5，胰蛋白胨1，NaCl 1；調節pH至7.0。

2）YPD培養基（g/dL）：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2。

3）MD培養基（g/dL）：酵母無氨基酸氮源（YNB）1.34，葡萄糖2，生物素4×10-5。

4）BMGY液體培養基（g/dL）：酵母膏1，蛋白胨2，YNB 1.34，生物素4×10-5，1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）1，甘油1。

5）BMMY液體培養基 （g/dL）：將BMGY中的1%甘油換成0.5%甲醇。

6）固體培養基是在液體培養基的基礎上添加1.5 g/dL瓊脂。

1.2.3 主要試劑的配制

1）100 mg/mL Amp：稱取0.5 g氨芐青霉素加入10 mL蒸餾水溶解，過濾除菌分裝后存于-20℃。

2）50 mg/mL G418：稱取1 g G418溶于20 mL蒸餾水中，0.22 μm濾器過濾除菌分裝（1 mL）后存于-20℃。

3）0.1 mol/L 3-吲哚乙酰酯：稱取17.519 mg的3-吲哚乙酰酯溶解于1 mL的二甲基亞砜中，避光室溫保存。

4）磷酸鹽緩沖液：按照分子克隆實驗指南配制。

1.3 宿主菌和質粒

大腸桿菌 DH5α：由作者所在實驗室保存；pMD20-T Vector：TaKaRa公司，巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）GS115及其胞內表達載體pPIC3.5K：作者所在實驗室提供。

1.4 引物設計與合成

依據實驗需要，參考實驗前期獲得的中華蜜蜂AChE基因序列，設計合成兩對引物。用于AChE cDNA RT-PCR的一對引物ACF和ACR，在ACF的5’端引入SnaBⅠ限制性內切酶位點，在ACR的5’端引入NotⅠ限制性內切酶位點、6×His標簽和終止密碼子TAA。乙醇氧化酶基因通用引物AOX5P和AOX3P是針對pPIC3.5K載體上的AOX基因而設計的引物。對于重組酵母轉化子的篩選和鑒定設計了重組子的特異性引物OACF/AOX3P，引物ACF/ ACR與AOX5P/AOX3P也可用于重組子的鑒定。所有引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，見表1。

表1 實驗中用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 RT-PCR與克隆基因的序列分析

提取中華蜜蜂 （AC）腦部組織Total RNA，以Total RNA為模板，經RT-PCR擴增出AChE cDNA全長，使用特異性引物ACF/ACR擴增出目的片段，將 PCR產物進行膠回收后連接到 pMD20-T Vector，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，在含100 ng/mL Amp的LB平板上過夜培養。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的菌株送蘇州金唯智生物科技有限公司進行DNA序列測定。所涉及的PCR擴增、膠回收、連接轉化及酶切方法均為分子克隆常規方法。

1.6 重組表達質粒的構建、轉化及鑒定

將測序正確的AChE基因克隆到pPIC3.5K載體上，利用電轉化法轉化畢赤酵母GS115，將重組表達盒整合入酵母基因組中，涂布于MD平板培養至出現單菌落。根據重組子在MD平板上的生長狀況及其遺傳霉素（G418）抗性初步篩選菌株，使用引物ACF和AOX3P通過菌落PCR反應進一步驗證重組菌株。

1.7 搖瓶誘導表達

培養基裝瓶體積分數10%，30℃、230 r/min振蕩培養。先用BMGY培養基種培養至OD600為4，離心收集菌體，用兩倍體積的BMMY培養基重懸細胞，轉移至新的三角瓶中誘導培養144 h，每24小時添加甲醇，保持終濃度為0.5%。為確定最佳誘導時間，在誘導后每24小時取樣500 μL，凍存于-70℃冰箱備用。

1.8 重組AChE的檢測

1.8.1 蛋白質表達水平測定 離心收集菌體，用預冷的pH 7.5的50 mmol/L Tris HCl（含2 mmol/L EDTA）緩沖液在振蕩儀作用下破碎細胞，離心，收集上清液，上清液即為胞內總蛋白質。將蛋白質樣品變性處理后進行SDS-PAGE電泳（濃縮膠4 g/dL，分離膠12 g/dL），使用考馬斯亮藍R250染色，分析目的蛋白質表達水平和相對分子質量。

1.8.2 蛋白質質量濃度測定 利用Bradford考馬斯亮藍G-250法[14]測定胞內總蛋白質的質量濃度。首先在96孔板中按1∶5比例加入不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）與考馬斯亮藍液，混合均勻后反應15 min，測A595，制定出蛋白質質量濃度標準曲線，接著測定樣品與考馬斯亮藍混合反應后的A595值，根據其A595值從標準曲線上查得樣品的蛋白質質量濃度。

1.8.3 酶活性檢測 以同時誘導過的轉化空載體的重組菌作為對照，利用微量羥胺比色法[15]在96孔板上對胞內總蛋白質進行顯色反應。在96孔板上加入200 μL的蛋白質樣品與4 μL、0.1 mol/L 3-吲哚乙酰酯混勻，室溫放置30 min，肉眼觀察顏色變化。在初步篩選出有活性的AChE的基礎上測定AChE的比酶活。

1.9 重組AChE的純化

誘導高活性的畢赤酵母重組菌株表達AChE 120 h后提取酵母胞內總蛋白質。按照海貍磁珠組氨酸標簽蛋白純化試劑盒用戶手冊純化蛋白質，并對純化過程中收集到的產物進行SDS-PAGE分析。實驗中用于純化的緩沖溶液：

1）Buffer A（Binding Buffer）：20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑。

2）Buffer B（Washing Buffer）：20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，100 mmol/L咪唑。

3）Buffer C（Elution Buffer）：20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑。

1.10 純化的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶用于有機磷殘留的檢測

購買的市售有機磷農藥檢測試劑盒是采用Ellman法[16]測定AChE的活性。采用純化的乙酰膽堿酯酶替換試劑盒中的乙酰膽堿酯酶粗酶液，利用試劑盒中已有的顯色劑和底物，在96孔板上按比例加入磷酸緩沖液、酶液、顯色劑（105∶10∶10），混勻，37℃放置5 min，加入與顯色劑等體積的底物，立即置于酶標儀中，測定405 nm波長下前3分鐘吸光度的變化值（ΔOD/min）。同時測定試劑盒中酶液的活性。

采用有機磷農藥氯吡硫磷作為抑制劑，利用上述方法測定405 nm波長下前3分鐘吸光度的變化值，計算抑制率（Ri）。

酶活性的計算公式=（ΔOD/min）/（1.36×104L/（mol·cm）×0.61cm）×103。

抑制率的計算公式：Ri（%）=（ΔA0-ΔA）/ΔA0

其中，ΔA0為不加抑制劑的酶活性反應吸光度變化值，ΔA為加入抑制劑的酶活性反應吸光度變化值。

2 結果與討論

2.1 AChE基因片段的克隆

采用特異性引物ACF/ACR，以中華蜜蜂頭部組織所提取的總RNA為模板，經RT-PCR擴增后，擴出1條約1.8 kb的條帶，與預期大小相一致，見圖1。

圖1 AChE cDNA的PCR擴增結果Fig.1 Result of PCR amplification of cDNA of AChE

2.2 重組AChE酵母表達載體的構建

克隆于pMD20-T上的AChE基因經測序鑒定正確后，用SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切并回收，與經相同的酶雙酶切后的畢赤酵母胞內表達空載體pPIC3.5K連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，得到的陽性菌經菌液PCR及雙酶切鑒定后，獲得重組表達質粒pPIC3.5K-AChE。重組表達質粒由蘇州金唯智科技公司測序，測序結果與預期的pPIC3.5KAChE相一致。整個質粒構建流程圖見圖2。

2.3 重組子的篩選鑒定

重組表達質粒經SalⅠ酶切線性化后即可電轉化畢赤酵母GS115。pPIC3.5K為酵母胞內表達載體，整個重組基因表達盒受上游的乙醇氧化酶（AOX1）啟動子的調控表達，pPIC3.5K的Kan基因賦予大腸桿菌卡那基因抗性，賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。以遺傳霉素基因（Kan）與組氨酸脫氫酶基因（His4）為篩選標志，用SalⅠ酶切的線性化表達載體pPIC3.5K-AChE約10.8 kb的表達單位，在山梨糖醇的介導下，于電擊杯中以750 V/mm的電壓作用，穿透酵母細胞壁及核膜，與畢赤酵母GS115的基因組發生同源重組。采用不同方法對轉化子進行篩選鑒定，利用MD平板進行表型篩選。獲得45個陽性轉化子，接著在含0.25 mg/mL G418的YPD平板上培養重組菌，利用pPIC3.5K-AChE基因上的特異性序列射擊類引物OACF和AOX3P，對陽性轉化子進行菌落PCR鑒定，由于該對引物只有含pPIC3.5K-AChE片段的載體才能擴增出，避免了畢赤酵母GS115中的AOX1基因與非特異性片段的干擾，擴增出與預期大小相一致的片段，約1 740 bp，PCR結果見圖3。

圖2 質粒構建流程Fig.2 Construction of plasmid pPIC3.5K-AChE

圖3 利用特異性引物對酵母轉化子的PCR鑒定Fig.3 PCR analysis of Pichia integrants with specific primer

2.4 搖瓶培養初篩高表達菌株

在對陽性轉化子進行多重鑒定的基礎上，對經PCR鑒定出的菌株進行小規模的誘導表達。由于蛋白質表達量有限，SDS-PAGE分析發現，在57 000處有一條與預期目的蛋白質大小一致的條帶（箭頭所指位置），但條帶并不是特別明顯，見圖4。作者所在實驗室在設計AChE基因插入pPIC3.5K時，方案為將基因插入到不含ATG的pPIC3.5K中，利用基因自身攜帶的337 bp處的ATG作為起始密碼子，其最終翻譯形成的蛋白質相對分子質量應為57 000。

圖4 誘導表達120 h后重組AChE的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant AChE after induced 120 h

用3-酰基吲哚顯色法檢測表達蛋白質的相對活性，發現含重組菌株在搖瓶10%培養120 h時，表達的AChE比活性最高。而與市場上購買的AChE相比，本實驗的重組AChE的活性略高于購買的AChE，顯色結果見圖5。

圖5 不同重組酵母表達的AChE與3-酰基吲哚的顯色反應Fig.5 Chromogenic reaction with 3-indoxyl acetate due to AChE of different strains

2.5 重組蛋白質純化

挑取比活性最高的重組菌株進行誘導表達，使用組氨酸標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白質，SDS-PAGE結果顯示，在經過兩次洗脫后，在57 000處有一條明顯的條帶，與預期大小相符，結果見圖5。

圖6 重組AChE純化過程的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant AChE at various stage of purification

2.6 純化的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶用于有機磷殘留的檢測

購買的市場上現有銷售的有機磷農藥殘留檢測試劑盒是可直接用于農藥檢測工作的，并未標明酶的來源及活性水平。因此用農藥殘留檢測試劑盒中的顯色劑與底物同時與純化的1.64×10-3mg中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶和1.64×10-3mg原試劑盒中的酶液反應，在96孔板上同時測定兩種酶液引起的405 nm處吸光度的變化值，計算出酶的比活性，發現試劑盒的酶液比活性為9 948 U/mg，而純化的中華蜜蜂AChE比活性為10 568 U/mg。使用濃度為1×10-7mol/L的氯吡硫磷作為抑制劑測定酶受氯吡硫磷抑制的抑制率，發現1×10-7mol/L的氯吡硫磷對重組乙酰膽堿酯酶和試劑盒中乙酰膽堿酯酶的抑制率分別為79%和75%，可以看出氯吡硫磷對本實驗純化得到的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶的抑制效果要高于市場上現有農殘檢測試劑盒中的酶。

可見純化的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶可以用于有機磷農藥殘留的檢測工作，且靈敏度更高。

3 結語

我國是世界第一養蜂大國，養蜂歷史悠久，約有2 000多年的歷史，目前我國飼養的蜜蜂主要是意大利蜜蜂、中華蜜蜂和東北黑蜂。其中，中蜂是我國獨有的蜜蜂當家品種。蜜蜂作為一類重要的經濟動物，不僅為人類提供了營養豐富功能多樣的蜂產品，而且在農業授粉促進植物繁衍和維持生態平衡中發揮著重要的作用[17]。2006年中華蜜蜂被列入農業部國家級畜禽遺傳資源保護品種，所以研究中蜂的生物學特性對我國本地蜂種的利用以及我國養蜂業的保護都有一定的促進意義，目前國內已開展了很多關于中華蜜蜂的研究[18-19]。據統計，我國每年使用農藥制劑100萬t左右[20]，而蜜蜂對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑極為敏感[21]。1990年至今，因農藥中毒導致蜜蜂死亡、蜂群數量驟減的現象遍及北美、歐洲、亞洲等許多國家和地區，已成為全球普遍關注的環境污染與生物安全問題[22]。研究中華蜜蜂AChE不僅可以用于食品安全中農藥殘留檢測工作，還可作為判斷中蜂是否接觸殺蟲劑的生化指標，為我國的養蜂事業做出巨大貢獻。

目前已有多種AChE利用畢赤酵母表達系統得到了很好的表達，例如，Ayman S.Hussein等[23]利用該系統表達了巴西日圓線蟲（Nippostrongylus brasiliensis）乙酰膽堿酯酶，Mendslson I等[24]利用該系統大量表達了電鰩（Torpedo californica）乙酰膽堿酯酶。在本研究中，作者構建了一系列含有中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶基因的畢赤酵母重組表達質粒，選擇了不同的線性化酶切位點，用于挑選出一組表達效果及酶活性水平較好的組合。在實驗中，我們依據前人的經驗，采用了多種方法來篩選和鑒定重組菌株，包括在MD和MM平板上進行Mut+和Muts表型篩選、遺傳霉素抗性篩選、特異性引物的菌落PCR。本實驗使用Ellman法來定義AChE的活力單位（1 U=1 μmolACh/min，即AChE在37℃、pH 7.2的條件下，每分鐘水解1 μmol的ACh定義為1個活力單位）。與市場上購買的農藥殘留檢測試劑盒中的AChE相比，本實驗得到的酶的比活力高于試劑盒中的AChE。而本實驗中酵母表達的胞內蛋白質由于培養條件、蛋白質提取方法和酶活測定方法均未經過優化，得到的酶活并不一定是其最佳活力。因此要得到更高的活力以及更靈敏地應用到農藥殘留檢測工作中，還需要進一步優化整個誘導表達工藝。

參考文獻：

[1]黃華飛.控制農藥殘留加強食品安全[J].農家之友，2008，12：75-76. HUANG Huafei.Control the pesticide residue to nhance food safety[J].Friends of the Farm，2008，12：75-76.（in Chinese）

[2]吳蘭團，陳國代.果蔬殘余農藥對人體危害芻議[J].南平師專學報，2001，20（4）：106-108. WU Lantuan，CHEN Guodai.A discussion of the harm to human health of pesticide residues in fruit and vegetable[J].Nanping Teachers Journal，2001，20（4）：106-108.（in Chinese）

[3]高桂枝，王圣巍，王俏，等.殘留農藥污染危害及其防治[J].延安大學學報：自然科學版，2002，21（1）：52-53. GAO Guizhi，WANG Shengwei，WANG Qiao，et al.The pollution hazard and prevention of pesticide residues[J].Yan'an University Journal：Natural Sciences，2002，21（1）：52-53.（in Chinese）

[4]于徊萍，王彩梅.食品農藥殘留分析的現代進展[J].吉林糧食高等專科學校學報，2001，16（1）：15-17. YU Huiping，WANG Caimei.Modern advances of pesticide residue analysis in food[J].Jilin Grain College Journal，2001，16（1）：15-17.（in Chinese）

[5]呂建華，安紅周，郭天松.農藥殘留對我國食品安全的影響及相應對策[J].食品科技，2006，11：16-20. LU Jianhua，AN Hongzhou，GUO Tiansong.The impact of pesticides on food safety and appropriate countermeasures[J].Food Science and Technology，2006，11：16-20.（in Chinese）

[6]伍小紅，李建科，惠偉.農藥殘留對食品安全的影響及對策[J].食品與發酵工業，2005，31（6）：80-84. WU Xiaohong，LI Jianke，HUI Wei.The influence of pesticide residues on food safety and countermeasure[J].Food and Fermentation Industries，2005，31（6）：80-84.（in Chinese）

[7]高曉輝.蔬菜上農藥殘留快速檢測勢在必行[J].農藥科學與管理，2000，21（1）：16-17. GAO Xiaohui.Rapid detection of pesticide residues on vegetables is imperative to implement[J].Pesticide Science and Administration，2000，21（1）：16-17.（in Chinese）

[8]王瀛寰，張艷峰，張旭，等.五種農藥對中華蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂的經口毒性比較[J].農藥學學報，2012，14（4）：453-456. WANG Yinghuan，ZHANG Yanfeng，ZHANG Xu，et al.Oral toxicity comparison of five kind of pesticides to drones of Apiscerana cerana and Apis mellifera[J].Pesticide Science Journal，2012，14（4）：453-456.（in Chinese）

[9]張瑩，黃建，高希武.兩種蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶對殺蟲藥劑敏感度比較[J].農藥學學報，2005，7（3）：221-226. ZHANG Ying，HUANG Jian，GAO Xiwu.Sensitive comparison of acetylcholinesterase to insecticides in two bees head[J]. Pesticide Science Journal，2005，7（3）：221-226.（in Chinese）

[10]MA Xingyuan，TAN Jianhua，WEI Dongzhi，et al.High-level secretion and purification of recombinant acetylcholinesterase from human cerebral tissue in P.pastoris and identification by chromogenicreaction[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，72：316-322.

[11]TAN Furong，WANG Ligang，WANG Jinbin，et al.Enhanced pesticide sensitivity of novel housefly acetylcholinesterases：a new tool for the detection of residual pesticide contamination[J].Bioprocess Biosyst Eng，2011，34（3）：305-314.

[12]LI Jingquan，BA Qian，YIN Jun，et al.Surface display of recombinant Drosophila melanogaster acetylcholinesterase for detection of organic phosphorus and carbamate pesticides[J].PLoS One，2013，8（9）：e72986.

[13]SATO R，MATSUMOTO T，HIDAKA N，et al.Cloning and expression of carp acetylcholinesterase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J].Protein Expr Purif，2009，64（2）：205-312.

[14]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[15]VILLATTE F，BACHMAN T T，HUSSEIN A S，et al.Acetylcholinesterase assay for rapid expression screening in liquid and solid media[J].Bio Techniques，2001，30：81-86.

[16]ELLMAN G L，COURTNEY K D，ANDRES V，et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J].Biochem Pharmacol，1961，7：88-95

[17]孔常興.蜜蜂及其作用[J].西藏科技，2010，8：15-19. KONG Changxing.The bees and their effect[J].Tibet Science and Technology，2010，8：15-19.（in Chinese）

[18]劉俊峰，劉亭亭，王歡，等.中華蜜蜂銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆-序列分析及表達特征[J].動物營養學報，2012，24（8）：1512-1519.LIU Junfeng，LIU Tingting，WANG Huan，et al.Cloning of Apiscerana cerana copper/zinc superoxide dismutase gene-sequence analysis and expression characteristics[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2012，24（8）：1512-1519.（in Chinese）

[19]倪翠俠，張林雅，李紅亮，等.中華蜜蜂化學感受蛋白基因家族克隆及表達分析[J].中國農業科學，2013，46（8）：1706-1715. NI Cuixia，ZHANG Linya，LI Hongliang，et al.Molecular cloning and expression profiles analysis of chemosensory protein genes family in the Chinese honeybee（Apis cerana cerana）[J].Scientia Agricultura Sinica，2013，46（8）：1706-1715.（in Chinese）

[20]王獻忠.我國農藥生產和使用現狀及其展望[J].科技信息（農林論壇），2011，13：777-816. WANG Xianzhong.The present situation and outlook of pesticides’production and usage in China[J].Science and Technology Information（Agriculture，Forestry Forum），2011，13：777-816.（in Chinese）

[21]RAHMAN M F，SIDDIQUI M K，ANJUM F，et al.Acute toxicity and anti acetylcholinesterase potential of some biphenyl derivatives to non target species[J].Indian J Exp Biol，1989，27（2）：138-140.

[22]卜元卿，單正軍，周軍英.農藥對蜜蜂生物毒性及安全性評價研究回顧[J].農藥，2009，48（6）：399-401. BO Yuanqing，SHAN Zhengjun，ZHOU Junying.A reviewof pesticides biological toxicity and safety evaluation to bees[J]. Agrochemicals，2009，48（6）：399-401.（in Chinese）

[23]HUSSEIN A S，CHACON M R，SMITH A M，et al.Cloning，expression，and properties of a nonneuronal secreted acetylcholinesterase from theparasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis[J].J Biol Chem，1999，274：9312-9319.

[24]MENDELSON I，KRONMAN C，ARIEL N，et al.Bovine acetylcholinesterase：cloning，expression and characterization[J].J Biochem，1998，334：251-259.

Cloning，Expression and Identification of Apiscerana cerana Acetylcholinesterase Gene in Pichia pastoris

CAO Xue1，2， CHEN Zhankuan3， BAI Zhonghu2， YANG Yankun*2， CHEN Jifeng1
（1.School of Life Science，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Henan Tianmao Biological Co. Ltd.，Zhengzhou 450001，China）

Organophosphate （OP） pollution is amajorhidden dangerto food safety，acetylcholinesterase can be used to detect the residual OP pesticide.Apiscerana cerana is a unique kind of Apoidea which has not been found in other countries except for China，and it has a high sensitivity to pesticides.On the other hand，acetylcholinesterase gene from Apiscerana cerana has not been cloned and applied in food safety detection.In this study，using the total RNA from Apiscerana cerana head tissue as a template，a 1.8kb AChE cDNA sequence was obtained by RACE method，then the target sequence was cloned into the yeast expression vector pPIC3.5K.AChE was expressed and located in Pichia pastoris GS115 after induced with 0.5%methanol.The SDS-PAGE and activityanalysis showed that Apiscerana cerana AChE gene was successfully cloned and expressed in Pichia pastoris for the first time.A strain with higher activity AChE was selected to express AChE，and its AChE activity was 10 568 U/mg，which could be used to detect the residual OP pesticide.

food safety，organophosphate detection，Apiscerana cerana acetylcholinesterase，Pichia pastoris，cloning and expression

Q 78

A

1673—1689（2016）12—1336—08

2015-01-30

中央高校基本科研業務費專項資金項目（JUSRP51401A）。

*通信作者：楊艷坤（1978—）男，河北石家莊人，理學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生物學、基因工程、分子遺傳、蛋白質的分離純化及特性等方面的研究。E-mail：yangyankun@jiangnan.edu.cn