重組大腸桿菌全細胞轉化馬來酸高效合成富馬酸

房月芹， 周 麗， 劉文茂， 周哲敏*

（1.江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

重組大腸桿菌全細胞轉化馬來酸高效合成富馬酸

房月芹1， 周 麗2， 劉文茂2， 周哲敏*2

（1.江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

重組Escherichia coli細胞催化馬來酸合成富馬酸時，細胞中富馬酸酶將產物富馬酸轉化成蘋果酸，轉化率達15.5%，降低了富馬酸的轉化率和純度。將E.coli BL21（DE3）基因組中fumA-fumC基因敲除，并高效表達馬來酸順反異構酶，重組菌BL21（DE3）△fumA-fumC/ pET24a-maiA經發酵罐培養，可產生64 g/L菌體，馬來酸順反異構酶表達量達306 U/mL。按照60 g/L的發酵液：2 mol/L富馬酸為1∶4的體積比配置反應液，37℃反應1 h，富馬酸轉化率高達98.4%，僅產生0.7%的蘋果酸副產物。該結果為全細胞催化法合成富馬酸的工業化奠定了基礎。關鍵詞：富馬酸；馬來酸順反異構酶；全細胞催化；蘋果酸

富馬酸（Fumaric acid），又稱反丁烯二酸、延胡 索酸，是一種天然存在的有機酸。作為一種重要的四碳平臺化合物和精細化工產品，富馬酸廣泛用于食品、醫藥、化工、涂料、增塑劑等領域[1]。例如，在食品方面，可用作口味純正的酸味劑、風味增強劑。在醫藥方面，富馬酸鐵則廣泛應用于醫學上治療人體的小紅血球貧血病。

目前，工業上主要以順丁烯二酸酐為原料通過化學轉化的方法生產富馬酸[2-3]。然而，化學轉化過程需高溫條件，化學反應平衡嚴格限制了轉化率，反應過程中形成副產物影響富馬酸的產量和產物的質量。以酶作為催化劑生產富馬酸，具有反應條件溫和、副產物少、特異性強、專一性高和轉化率高等優點。馬來酸順反異構酶（EC 5.2.1.1，Maleate cistrans Isomerase，MaiA）屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族[4]，能夠催化馬來酸在碳碳雙鍵不斷裂的情況下異構化生成富馬酸。其中，粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）來源的馬來酸順反異構酶具有轉化率高、pH范圍寬泛、Km值較低等特點，是有望用于工業生產富馬酸的生物催化劑之一[5]。作者所在實驗室前期用Serratia marcescens來源的馬來酸順反異構酶的游離酶轉化馬來酸合成富馬酸，轉化率可達99%[6]。進一步使用含有該酶的細胞進行生物催化反應，可避免游離酶提取和純化成本高、穩定性低、回收利用困難等問題[7]。同時，全細胞催化只需對細胞進行培養就能獲得大量的全 細胞 生物催化劑，通過簡單的過濾或者離心就能對產品進行分離純化[8]，簡化了生物催化劑的制備步驟，在許多工業生物轉化過程都得到應用。然而，細胞內同時存在多種酶，全細胞生物轉化工程中最嚴重的問題是會產生副產物[9]。例如用全細胞催化馬來酸合成富馬酸時，富馬酸酶（又名延胡索酸水合酶）的存在導致富馬酸被轉化成L-蘋果酸，降低富馬酸的轉化率和純度。Ichikawa等[10]通過加熱方法將產堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）XD-1中的富馬酸酶失活，從而將XD-1全細胞轉化合成富 馬 酸的轉化率由69.8%提高為95%。然而，加熱易導致細胞裂解，釋放復雜的細胞內含物質，影響產品質量。

作者敲除大腸桿菌BL21（DE3）中的fumA-fumC和fumB基因，減少富馬酸到L-蘋果酸的代謝通路。以所獲得的重組菌株為宿主，表達來源于Serratia marcescens的馬來酸順反異構酶。最終獲得的重組細胞可高效轉化馬來酸底物合成高純度富馬酸，幾乎不合成蘋果酸副產物，為全細胞法催化馬來酸生產富馬酸的工業化提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與引物

菌株E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-maiA、重組質粒pET-24a（+）-maiA：由作者所在實驗室構建和保藏[6]；質粒pKD46（溫度敏感型，含有阿拉伯糖啟動子調控的 gam，bet和 exo基因，Ampr）、pKD13（含有FRT-kan-FRT突變盒，Kanr）、pCP20（溫度敏感型，含有FLP重組酶，Ampr）：購于耶魯大學基因保藏中心[11]。

本研究所用引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 主要試劑與培養基

ExTaq DNA聚合酶：寶生物工程（大連）公司；質粒提取、純化試劑盒、抗生素：生工生物工程（上海）股份有限公司；馬來酸、富馬酸及其他試劑：國藥化學試劑有限公司產品。

LB培養基成分為（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

搖瓶發酵培養基（g/L）：甘油10，胰蛋白胨12，酵母粉 12，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 16.4，KH2PO4·12H2O 6.1。

發酵罐種子培養基（g/L）：LB培養基。

發酵罐發酵培養基（g/L）：甘油8，胰蛋白胨2，酵 母 粉 2，C6H8O7·H2O 1.7，MgSO4·7H2O 1.7，（NH4）2HPO44，KH2PO413.5；微量元素液10 mL。

補料培養基（g/L）：甘油500，胰蛋白胨4，酵母粉4，MgSO4·7H2O 7.4。

微量元素成分為（g/L）：FeSO4·7H2O 10，CuSO4· 5H2O 1，MnSO4· 4H2O 0.5，ZnSO4· 7H2O 2.3，（NH4）MO7O240.1，Na2B4O7·10H2O 0.2，CaCl22，溶于1 mol/L HCl溶液中。

1.3 重組菌株搖瓶發酵培養方法

-80℃冰箱保存的重組菌株在LB固體平板上劃線活化，挑取LB平板上單菌落，接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養8 h。上述培養液以1%的接種體積分數轉接入30 mL含50 μg/mL卡那霉素的搖瓶發酵培養基，于37℃恒溫搖床中200 r/min培養至OD600約為2.2時，加入乳糖至終質量濃度為4 g/L，同時移至20℃恒溫搖床中進行誘導表達，200 r/min繼續培養20 h。

1.4 重組菌株發酵罐發酵培養方法

1.4.1 種子培養方法 取-80℃冰箱的甘油管保藏物200 μL菌液接種于30 mL含有50 μg/mL卡那青霉素抗性的LB培養基中，置于37℃的恒溫搖床中200 r/min培養7.5 h。

1.4.2 發酵罐培養方法 5 L發酵罐 （Winpact FS-02，Major Science，Saratoga，CA，USA）初始裝液量為2 L。培養溫度設定為37℃，初始轉速200 r/min，通氣量為5 L/min，設定此時罐內初始溶解氧（DO）100%。將種子培養液以7%的接種體積分數接入發酵罐中，同時加入終質量濃度為50 μg/mL的卡那青霉素，將發酵罐的溶氧與轉速相偶聯，維持罐內溶氧濃度在30%。接種約5~6 h后出現溶氧反彈現象，此時以指數流加補料策略補加補料培養基，控制菌體比生長速率（μ）為0.25（h-1）。當OD600達到60時，改變溫度為30℃，并以0.22 g/（L·h）的恒流速流加乳糖進行誘導。整個發酵用體積分數25%的氨水維持pH在7.2。

1.4.3 指數補料控制策略 發酵罐培養過程中，以甘油為限制性底物，根據以下公式[12]進行指數補料，控制恒定的比生長速率：

其中，F（t）是補料速率（L/h）；X0和V0分別是分批補料初始階段的細胞干重（g/L）和培養基體積（L）；μset是設定的比生長速率（h-1）；t為流加時間（h）；Yx/s是細胞對底物的得率系數（g/g），其經驗值為0.46 g/g；Sf和S0分別是補料培養基和分批發酵結束后發酵罐中的甘油質量濃度（g/L）。實驗中補料速率（F）每2小時改變一次。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體量測定方法 菌體密度采用濁度法間接測量，通過OD600來表示，并換算為菌體干重（DCW）。取不同濃度的菌液，8 000 r/min離心10 min去上清液，用去離子水洗滌3次，將菌體放于-80℃預冷凍24 h，用冷凍干燥機處理72 h，將干燥后菌體質量與對應的細胞密度繪制曲線，得到菌體干重（DCW）和OD600的關系：1 OD600=0.408 3 g/L DCW。

1.5.2 全細胞馬來酸順反異構酶酶活測定方法

1）細胞預處理方法：離心收集發酵液中的菌體，用pH 8的66.7 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌1次。

2）粗酶液制備方法：菌體洗滌后，用超聲波破碎細胞，12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。取100 μL適度稀釋的菌液或粗酶液，加入50 μL 1 mol/L的馬來酸溶液，用 50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液將反應體系補充到500μL，于指定溫度下保溫10 min。100℃煮沸10 min，離心，取上清液稀釋50倍，測定生成的富馬酸含量。

酶活力單位定義：在上述反應條件下，每分鐘轉化生成1 μmol富馬酸產物所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

相對酶活計算公式為：

其中，Yrel是相對酶活 （%）；Y是本樣品的酶活（U）；Ymax是本次實驗所有樣品中最高的酶活（U）。

1.5.3 馬來酸、富馬酸和蘋果酸的測定方法 馬來酸、富馬酸和蘋果酸濃度用高效液相色譜（HPLC）法測定。HPLC檢測條件：色譜柱Prevail Organic Acid（250 mm×4.6 mm，5 μm；Grace Davison Discovery Sciences），流動相為pH 2.5的25 mmol/L K2HPO4溶液，流速1 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測器波長210 nm，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 BL21（DE3）/pET24a-maiA全細胞轉化馬來酸合成富馬酸

按照BL21（DE3）/pET24a-maiA發酵液：2 mol/L富馬酸為1∶4的體積比配置反應液，在40℃下反應3 h。由圖1可見，BL21（DE3）/pET24a-maiA全細胞反應過程中，底物馬來酸主要轉化為富馬酸，并積累蘋果酸副產物，導致目的產物富馬酸的轉化率和純度降低，不利于產品的應用。

圖1 BL21（DE3）/pET24a-maiA全細胞轉化馬來酸合成富馬酸過程Fig.1 Biosynthetic process of fumarate from malaete by BL21（DE3）/pET24a-maiA cell

2.2 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA和BL21（DE3）△fumB/pET24a-maiA菌株的構建

E.coli的TCA循環中具有富馬酸酶，能夠催化富馬酸水合生成L-蘋果酸。富馬酸酶有3個同工酶[13]，分別是FumA、FumB、FumC，其中FumA在有氧條件下參與TCA循環的運行[14]；FumB在厭氧條件下有功能[15]；FumC是酶學性質和FumA類似的備用酶，并且在脅迫環境中可以代替FumA行使功能[14]。因此，為了保證富馬酸產物的高效合成，降低副產物的積累，作者進一步將富馬酸酶的編碼基因敲除。fumA和fumC基因在基因組中位于相鄰的位置，所以將這兩個基因同時敲除，保留fumB基因；或者保留fumA和fumC基因，敲除fumB基因，以維持菌體生長。

用Datsenko等[11]報道的基因刪除方法，分別將BL21（DE3）染色體上的fumA-fumC和fumB基因刪除。其具體過程為：以pKD13質粒為模板，分別用FumC-pKD13F/FumA-pKD13R引物和 FumB-pKD13F/FumB-pKD13R引物進行PCR擴增，得到兩端為同源臂、中間為FRT-kan-FRT基因片段的線性同源重組片段（大小為1 303 bp）。將同源重組片段分別電轉入含有pKD46質粒的BL21（DE3）菌株中，借助pKD46質粒上的Red重組系統將同源重組片段整合于染色體上，在卡那霉素抗性平板上篩選轉化子。重組菌株PCR驗證結果見圖2。出發菌株BL21（DE3）、轉化子BL21（DE3）fumA-fumC：：FRTKm分別用YfumCF/YfumAR引物PCR擴增，其電泳條帶分別為3 526 bp和2 036 bp；BL21（DE3）和 BL21（DE3）fumB：：FRTKm分別用 YfumBF/ YfumBR引物PCR擴增，其電泳條帶分別為1 660 bp和1 716 bp，表明fumA-fumC和fumB基因成功被FRT-kan-FRT片段替換。最后用pCP20質粒去除重組菌中的卡那霉素抗性基因，轉化子BL21（DE3）fumA-fumC：：FRT和BL21（DE3）fumB：：FRT分別用YfumCF/YfumAR引物和YfumBF/YfumBR引物PCR擴增，其電泳條帶為438 bp和494 bp，表明fumA-fumC和fumB基因已經被成功敲除。所獲得的重組菌株分別命名為BL21（DE3）△fumA-fumC和BL21（DE3）△fumB。

進一步將pET24a-maiA質粒分別轉化到BL21（DE3）△fumA-fumC和 BL21（DE3）△fumB菌株中，分別獲得BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA和BL21（DE3）△fumB/pET24a-maiA菌株。

2.3 fumA-fumC和fumB基因刪除對全細胞催化過程中蘋果酸積累量的影響

收集BL21（DE3）/pET24a-maiA、BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA和BL21（DE3）△fumB/ pET24a-maiA菌體，并用 pH 8的 66.7 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸至OD600=10。取菌液各1 mL，加入4 mL 500 mmol/L的馬來酸溶液中，在40℃、pH 8條件下反應10 min。如表2所示，菌株BL21（DE3）△fumB/pET24a-maiA的反應液中，蘋果酸副產物的積累量與出發菌株相似，而菌株BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA僅產生了少量的蘋果酸副產物。因此，fumA-fumC基因是全細胞催化反應過程中蘋果酸合成的主要途徑，BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA菌株更適合應用于全細胞催化馬來酸合成富馬酸。

圖2 基因敲除菌株PCR驗證電泳圖Fig.2 PCR identification of the deletion strains

表2 蘋果酸副產物積累量的比較Table 2 Comparison of malate byproduct

2.4 菌株 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA發酵罐發酵性能

進一步將BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA菌株在5 L罐發酵中培養，考察其菌體生長與馬來酸順反異構酶合成性能。由圖3可知，發酵培養最高可獲得干重達64 g/L的菌體細胞，最高酶活可達306 U/mL。表明基因敲除后仍可實現菌體和馬來酸順反異構酶的高效合成，顯示出大規模應用的潛力。

2.5 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA菌全細胞催化的最適溫度和pH優化

BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA的菌體分別在pH 8、不同溫度下以100 mmol/L馬來酸為底物催化10 min，測定相對酶活。細胞催化馬來酸合成富馬酸的活性隨溫度升高而升高，當溫度升高到50℃時達到最大催化能力，之后隨溫度升高酶活很快下降，見圖4（a）。

BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA菌體分別在50℃、不同pH下測定相對酶活。由圖4（b）可知，溶液pH對全細胞催化活性影響不大，在pH 8.3時獲得最高酶活。這可能是因為外界pH的改變對胞內環境影響較小，導致細胞對馬來酸催化活性不受顯著影響。

圖3 菌株BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA 5 L發酵罐發酵菌體生長及產酶曲線Fig.3 Growth and enzyme production status of BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA in5L bioreactor

圖4 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA全細胞催化最適溫度和pHFig.4 Optimum temperature and pH of BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA

2.6 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA全細胞催化的穩定性

如果將全細胞應用于工業化富馬酸的生產，為產品純度和提純工藝考慮，菌液添加量不宜過大，底物濃度應盡量增大，這就需要延長細胞催化時間。而大腸桿菌細胞在高溫條件下易裂解，因此對細胞的溫度穩定性進行考察。由圖5可以看出，在大腸桿菌最適生長溫度37℃下保溫10 h后，細胞依然保留75%的初始酶活性；而在細胞最適催化溫度50℃下保溫3 h后，細胞僅具有25%的初始酶活性，所以37℃更適宜工業化的長時間催化。此外，細胞在37℃時的催化活性可達50℃下的90%，并且比50℃高溫條件的能耗低，因此，37℃下進行全細胞反應更為適宜。

圖5 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA細胞在37℃和50℃下穩定性比較Fig.5 Stability of BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24amaiA at 37℃and 50℃

2.7 BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA全細胞催化馬來酸生產富馬酸的性能

重組菌株經5 L罐發酵培養，按照發酵液（菌體細胞干重為60 g/L）∶2 mol/L富馬酸體積比為1∶4配置反應液，在37℃下催化1 h。由表3可見，原始菌株蘋果酸副產物積累量達0.25 mol/L，僅產生1.34 mol/L的富馬酸，富馬酸摩爾轉化率僅為84%；BL21△fumA-fumC/pET24a-maiA則僅生成0.011 mol/L的蘋果酸，富馬酸的合成量提高為1.57 mol/L，富馬酸轉化率提高為98.4%，高于Ichikawa等[10]用產堿假單胞菌 （Pseudomonas alcaligenes）XD-1進行全細胞催化的結果（富馬酸產量為0.49 mol/L，富馬酸對馬來酸的轉化率95%）。

表3 細胞催化馬來酸合成富馬酸性能比較Table 3 Comparison of whole-cell biocatalysis of fumarate from maleate

3 結語

作者用Red重組方法對E.coli BL21（DE3）進行改造，分別敲除基因組中的fumA-fumC以及fumB基因，表明fumA-fumC基因編碼的代謝途徑是全細胞催化馬來酸合成富馬酸過程中副產物蘋果酸合成的主要途徑。重組菌株 BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA經發酵罐培養可實現菌體（64 g/L）和馬來酸順反異構酶的高效合成（306 U/mL）。該發酵液可將1.6 mol/L的馬來酸轉化為1.57 mol/L富馬酸，富馬酸轉化率提高到98.4%，而蘋果酸的轉化率僅為0.7%，顯示出較好的工業應用潛力。

[1]ROA ENGEL C A，STRAATHOF A J J，Zijlmans T W，et al.Fumaric acid production by fermentation[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78（3）：379-389.

[2]關共湊，黃耀威.由糠醛合成富馬酸[J].廣州化工，2001，29（2）：20-22. GUAN Gongcou，HUANG Yaowei.Synthesis of fumaric acid from furfural[J].Guang Zhou Chemical Industry and Technology，2001，29（2）：20-22.（in Chinese）

[3]蘇秋芳，陳少華.KBr-H2O2催化順酐異構化合成富馬酸[J].化學試劑，2001，23（2）：120-121. SU Qiufang，CHEN Shaohua.Synthesis of fumaric acid by isomerization of maleic anhydride with KBr-H2O2as catalyst[J]. Chemical Reagents，2001，23（2）：120-121.（in Chinese）

[4]YASUO K，JINSAKU Y，YASUHISA A.Maleate cis-trans isomerase from Arthrobacter sp.TPU 5446[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1995，80（6）：610-612.

[5]KAZUHISA H，MAKOTIO G，ASUKAZI U，et al.Molecular analysis of maleate cis-trans isomerase from thermophilic bacteria [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2000，64（3）：569-576.

[6]王亞，崔文璟，周麗，等.粘質沙雷氏菌馬來酸順反異構酶表達純化及酶學性質[J].食品與生物技術學報，2014，33（11）：1204-1209. WANG Ya，CUI Wenjing，ZHOU Li，et al.Purification and characterization of maleate cis-trans isomerase from Serratia marcescens[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（11）：1204-1209.（in Chinese）

[7]ISHIGE T，HONDA K，SHIMIZU S.Whole organism biocatalysis[J].Current Opinion in Chemical Biology，2005，9（2）：174-180.

[8]RICHTER N，NEUMANN M，LIESE A，et al.Characterization of a whole-cell catalyst co-expressing glycerol dehydrogenase and glucose dehydrogenase and its application in the synthesis of L-glyceraldehyde[J].Biotechnolgy and Bioengineering，2010，106（4）：541-552.

[9]NIKOLOVA P，WARD O P.Whole-cell biocatalysis in nonconventional media[J].Journal of Industrial Microbiology，1993，12（2）：76-86.

[10]ICHIKAWA S，IINO T，SATO S，et al.Improvement of production rate and yield of fumaric acid from maleic acid by heat treatment of Pseudomonas alcaligenes strain XD-1[J].Biochemical Engineering Journal，2003，13（1）：7-13.

[11]DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（12）：6640-6645.

[12]LEE S Y.High cell-density culture of Escherichia coli[J].Trends in Biotechnology，1996，14（3）：98-105.

[13]WOODS S A，SCHWARTZBACH S D，GUEST J R.Two biochemically distinct classes of fumarase in Escherichia coli[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1988，954（1）：14-26.

[14]PARK S J，GUNSALUS R P.Oxygen，iron，carbon，and superoxide control of the fumarase fumA and fumC genes of Escherichia coli-role of the arcA，fnr，and soxR gene-products[J].Journal of Bacteriology，1995，177（21）：6255-6262.

[15]TSENG C P.Regulation of fumarase（fumB）gene expression in Escherichia coli in response to oxygen，iron and heme availability：role of the arcA，fur，and hemA gene products[J].FEMS Microbiology Letters，1997，157（1）：67-72.

Efficient Production of Fumarate from Maleate Using Recombinant E.coli as Whole Cell Biocatalyst

FANG Yueqin1， ZHOU Li2， LIU Wenmao2， ZHOU Zhemin*2
（1.School of Environment and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Fumarate could be produced from maleate with whole cell of recombinant Escherichia coli.However，malate，with a yield of 15.5%，was generated as byproduct by the cellular fumarase，resulting in a decreased fumarate yield and purity.The chromosomal genes，fumA and fumC，in E. coli BL21（DE3）were inactivated，followed by over expression of the maleate cis-trans isomerate. After cultured in a bioreactor，the resulting strain BL21（DE3）△fumA-fumC/pET24a-maiA could generate 64 g/L dry cell weight and maleate cis-trans isomerate of 306 U/mL.With a volumetric ratio of fermentation broth（60 g/L dry cell weight）：fumarate（2 mol/L）=1∶4，fumarate yield of 98.4%and malate yield of 0.7%were produced after incubation at 37℃for 1 h.These results laid a foundation for industrial production of fumarate by whole-cell biocatalyst.

fumarate，maleate cis-trans isomerate，whole-cell biocatalysis，malate

Q 815

A

1673—1689（2016）12—1323—07

2015-07-08

江蘇省自然科學基金項目（BK20130131，BK20130139）；江蘇省產學研聯合創新資金——前瞻性聯合研究項目（BY2014023-21）。

房月芹（1969—），女，安徽碭山人，理學碩士，講師，主要從事微生物方面的研究。E-mail：yqfang2003@hotmail.com

*通信作者：周哲敏（1969—），男，河北石家莊人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵工程方面的研究。

E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn