階段控溫提高透明質酸酶在畢赤酵母中的表達

張 娜， 李江華*， 金 鵬， 堵國成， 陳 堅， 康 振

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

階段控溫提高透明質酸酶在畢赤酵母中的表達

張 娜1，2， 李江華*1，2， 金 鵬1，2， 堵國成1，2， 陳 堅1，2， 康 振1，2

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

透明質酸酶（Hyalurondiase，HAase）是一種具有醫藥作用的水解酶，為了提高HAase在重組畢赤酵母中的分泌表達量，對重組畢赤酵母誘導階段的溫度進行了優化。研究發現，降低誘導溫度可以提高HAase的產量，其中兩階段控制溫度誘導策略效果最為顯著。誘導階段0~60 h溫度控制在25℃，60~96 h溫度控制在22℃，HAase酶活最高為1.18×106U/mL，是誘導溫度為30℃時（4.53×105U/mL）的2.6倍。此外，采用兩階段控制溫度誘導策略有利于細胞活性的提高和AOX1啟動子的表達。兩階段控制溫度誘導策略還可以應用到其他酵母表型中，為畢赤酵母高效表達外源蛋白質提供一種新思路。

透明質酸酶；畢赤酵母；兩階段控制溫度；分泌表達

透明質酸酶（Hyalurondiase，HAase）是一種降解透明質酸的水解酶，廣泛存在于動物組織與微生物中。根據HAase的作用機制，將其分為3大類[1]：第一類為內切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，作用于β-1，4-糖苷鍵，主要產物為四糖，主要來源于哺乳動物；第二類為內切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，作用于β-1，4-糖苷鍵，通過β-消去機制得到4，5-不飽和雙糖，主要來源于細菌；第三類為內切-β-葡糖苷酸酶，作用于β-1，3-糖苷鍵，主要來源于水蛭。目前市場上出售的HAase主要是從活體的牛和羊的睪丸組織中提取，存在雜蛋白質較多，純度較低，免疫原性較強等問題。而重組的水蛭HAase沒有任何交叉感染，因此重組水蛭HAase可以應用于治療臨床醫療如眼科、內科和外科手術等。此外重組水蛭HAase能專一性的降解透明質酸，產物在窄普基質范圍內[2-3]，可以用它來獲得小分子透明質酸。

近年來，HAase已經在枯草芽孢桿菌和畢赤酵母中實現了表達，HAase在枯草芽孢桿菌中的產量達到1.50×104U/mL[4]，在畢赤酵母中的產量為6.31× 104U/mL[5]，這說明畢赤酵母作為HAase的表達宿主具有無可比擬的優勢，同時通過基因工程手段表達重組HAase也突破了水蛭原料來源的限制和繁瑣提取分離步驟等因素的限制，能夠推動HAase在醫療和科研上的廣泛應用。然而目前報道的畢赤酵母中的HAase的表達量依然較低距離實現工業化還有一段距離，因此如何提高HAase在畢赤酵母中的表達量是一個亟待解決的問題。外源蛋白質在畢赤酵母中表達，發酵培養條件是提高其表達量很重要的因素，在發酵培養條件中，溫度是影響細胞生長和目的蛋白質產率及穩定性的一個重要因素[6-8]。降低溫度可以降低細胞的死亡率，同時也可以降低目的蛋白質的降解[9-10]，提高AOX轉錄水平[11]。

作者在構建表達重組HAase的畢赤酵母重組菌株的基礎上研究誘導溫度對HAase表達的影響，通過改變誘導溫度來提高HAase的表達量，同時為提高外源蛋白質在畢赤酵母工程菌中的高效表達提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 P.pastoris GS115-HAase由作者所在實驗室構建，其特性以P.pastoris GS115為宿主，整合來自水蛭的透明質酸酶基因 （GenBank登錄號KJ026763），同時具有His+和Mut+表型。

1.1.2 培養基

1）YPD活化培養基（g/L）：酵母提取物 10，蛋白胨20，葡萄糖20。裝液量為50 mL培養基/500 mL三角瓶。

2）分批發酵培養基 BSM （g/L）：CaSO4·2H2O 0.93，K2SO418.2，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，甘油40.0；85%磷酸 26.7 mL，PTM1 4.35 mL。裝液量為800 mL培養基/3 L發酵罐。

3）PTM1（g/L）：CuSO4·5H2O 6，KI 0.09，MnSO4· H2O 3，H3BO30.02，MoNa2O4·H2O 0.2，CoCl20.5，ZnCl220，FeSO4·7H2O 65，生物素 0.2；濃H2SO45.0 mL。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養 劃線活化菌種，挑取單菌落接種于YPD培養基中，于30℃、200 r/min培養24 h。

1.2.2 高密度分批發酵培養 將搖瓶培養的YPD種子液以10%的接種體積分數接種到3 L全自動發酵罐（LiFlus GM BioTRON，Korea）中，溫度控制在30℃，使用25%氨水調節pH 5.5，初始攪拌轉速為500 r/min，通氣量為2.5 L/min，溶氧維持在30%以上。培養28 h，OD600約70~80待甘油耗盡，流加50 g/dL甘油（含12 mL/L PTM1），停止補料待甘油再次耗盡，OD600約220（干重約60 g/L），流加100%甲醇（含12 mL/L PTM1），甲醇的質量濃度控制在18 g/L[12]，誘導溫度分別采用30、25、22℃及兩階段控制溫度誘導策略。

1.2.3 菌體濃度測定

1）OD600測定方法：將發酵液用pH 6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋合適倍數，在600 nm下測定吸光值。

2）菌體干重的測定方法：取10 mL發酵液，10 000 r/min離心10 min，菌體使用pH 6.0磷酸鹽緩沖液重懸，洗滌兩次，放置于105℃烘箱，烘干至恒質量，稱量并計算菌體干重（g/L）。

1.2.4 細胞活力測定 亞甲基蘭染色法[10]：將稀釋好的發酵液以1∶1加入0.4%亞甲基蘭，染色2~3 min。

細胞活力=（細胞總數-染色的細胞數）/細胞總數。

1.2.5 醇氧化酶AOX活力測定 醇氧化酶活力單位（1U）定義為：每分鐘產生1 μmoL的過氧化氫所需的酶量。酶活力測定方法見文獻[13]。

1.2.6 水蛭透明質酸酶活力測定 水蛭透明質酸酶的活力單位定義為：在pH 5.5和38℃下，每小時從透明質酸中釋放1 μg葡萄糖還原當量的還原糖所需的酶量。

酶活力測定方法采用DNS法[14]。具體的測定方法為：反應體系共3 mL，2 mL DNS溶液中分別加入0，50，75，100，125，150，175，200 μL的葡萄糖標準液 （2 mg/mL），加水補足到3 mL，沸水浴煮沸10 min，冷卻至室溫，加水補足到10 mL，在540 nm下測定吸光度，以吸光度為橫坐標，以葡萄糖質量濃度為縱坐標制作標準曲線。

樣品的測定需要配置如下試劑：2 mg/mL透明質酸，50 mmol/L、pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。反應體系1 mL，800 μL透明質酸，稀釋一定倍數的發酵上清液，緩沖液補足1 mL，38℃水浴鍋中反應15 min，用1 mL反應的樣品代替葡萄糖標準液，測定吸光值代入標準曲線求得還原當量的葡萄糖質量濃度，根據水蛭透明質酸酶的活力定義，進一步求得透明質酸酶酶活。

2 結果與分析

溫度對畢赤酵母生長和重組蛋白質的表達具有很重要的影響，主要通過影響菌體的生長和細胞代謝。溫度升高菌體胞內代謝加速，使得菌體過早的老化，過低的溫度影響胞內酶的活性，從而影響胞內代謝，最終影響菌體的生長和重組蛋白質的表達。

2.1 誘導溫度對菌體濃度和HAase表達的影響

畢赤酵母生長溫度為28~30℃，考慮到過高的溫度會造成菌體過早的衰老，一定程度的降低溫度有利于重組酶的表達，因此考察了不同溫度（30、25、22℃）對HAase表達的影響，發酵結果見圖1—3。不同誘導溫度對菌體干重影響較小，對HAase表達較大。當溫度為30℃時，誘導72 h，菌體干重最高達到182.7 g/L，HAase酶活最高為4.53×105U/mL。72 h后，隨著溶氧反彈，菌體干重緩慢降低，同時HAase酶活也緩慢下降，可能溫度過高造成細胞不利的影響；誘導溫度為25℃時，誘導90 h菌體干重最高為187.6 g/L，HAase酶活最高為8.56×105U/mL，為誘導溫度30℃的1.89倍；誘導溫度為22℃時，誘導90 h菌體干重最高為189.8 g/L，HAase酶活最高為1.04×106U/mL，為誘導溫度30℃的2.3倍。由不同誘導溫度對HAase表達的影響可知，降低溫度有利于HAase的表達。

圖1 誘導溫度為30℃時的分批發酵培養對HAase酶活的影響Fig.1 Effect of induction temperature 30℃ on the HAase by fed-batch fermentation

圖2 誘導溫度為25℃時的分批發酵培養對HAase酶活的影響Fig.2 Effect of induction temperature 25℃ on the HAase by fed-batch fermentation

圖3 誘導溫度為22℃時的分批發酵培養對HAase酶活的影響Fig.3 Effect of induction temperature 22℃ on the HAase by fed-batch fermentation

2.2 誘導溫度對細胞活力的影響

前期研究表明，表達階段溫度降低與細胞生長和細胞活性呈現正相關[9]，對不同誘導溫度下的細胞活力進行測定，結果見圖4。誘導溫度為30℃時，誘導48 h時細胞活力降低到80%，誘導96 h時細胞活力下降到40%以下。誘導溫度為25℃時，誘導0~60 h，細胞活力維持在90%以上，60~96 h，細胞活力維持在80%以上。誘導溫度為22℃時，誘導0~ 96 h細胞活力維持在90%以上。由不同誘導溫度對細胞活力的影響可知，高溫對細胞活力不利，可能是溫度過高導致細胞提前衰亡，從而影響細胞活力。

圖4 不同誘導溫度對細胞活力的影響Fig.4 Effect of different induction temperature on the cell viability

2.3 誘導溫度對醇氧化酶AOX酶活力影響

溫度還能影響AOX酶活性，降低溫度可提高AOX基因轉錄水平3~5倍[14]，故考察不同誘導溫度對AOX酶活力的影響，結果見圖5。誘導溫度為30℃時，誘導36 h，AOX酶活達到最高值1 251 U/mL。誘導96 h，AOX酶活下降為804 U/mL；當誘導溫度為25℃時，誘導60 h，AOX酶活最高達到1 530 U/mL。誘導96 h時，AOX酶活為1 410 U/mL；誘導溫度為22℃時，誘導60 h，AOX酶活最高為1 653 U/mL。誘導96 h，AOX酶活力維持在1 621 U/mL且較穩定。由溫度對AOX酶活的影響可知，降低溫度能夠提高AOX酶活力。

2.4 兩階段控制溫度誘導策略對HAase表達影響

由不同誘導溫度下細胞活力與醇氧化酶AOX酶活力的影響，結合HAase的發酵過程，發現當誘導溫度分別為25℃與22℃時，誘導0~60 h，細胞活力維持在90%以上，AOX酶活力達到最高，且HAase酶活力增加速度幾乎相同。60~96 h，兩個誘導溫度下有明顯的區別，誘導溫度為25℃時，細胞活力下降到80%，AOX酶活力緩慢下降。而誘導溫度為22℃時，細胞活力維持在90%以上，AOX酶活力幾乎穩定且HAase酶活力增加速度加快。基于此研究結果，我們提出了一個兩階段控制溫度誘導策略即誘導0~60 h，溫度控制為25℃；60~96 h，溫度控制為22℃，結果見圖6。采用兩階段控制溫度誘導策略，誘導60~72 h細胞活力和AOX酶活力緩慢增加，72~96 h幾乎不變，同時HAase表達速度加快，誘導96 h，菌體干重為190 g/L，HAase酶活最高達到1.18×106U/mL，是誘導溫度30℃的2.6倍。因此，兩階段控制溫度誘導策略比單一的降低溫度更有利于外源蛋白質的表達。

圖5 不同誘導溫度對醇氧化酶AOX酶活力的影響Fig.5 Effect of different induction temperature on the AOX activity

圖6 兩階段控制溫度誘導策略的分批發酵培養對HAase表達影響Fig.6 Effect of two-stage temperature induction strategy on the HAase by fed-batch fermentation

3 結語

通過研究不同誘導溫度對細胞活力、AOX酶活力以及HAase酶活力的影響，確定了一種最適誘導表達HAase的策略，即兩階段控制溫度誘導策略，采用此策略后，HAase酶活最高達到1.18×106U/ mL，是誘導溫度30℃的2.6倍，實現了HAase在畢赤酵母中的高效表達，說明兩階段控制溫度誘導策略更能提高HAase的表達，為畢赤酵母提高外源蛋白質表達提供了一種新思路，同時為實現HAase的工業化生產奠定了基礎。此外進一步通過對畢赤酵母表達系統的上游進行優化，進一步提高HAase的表達。

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Enhanced Expression of Hyalurondiase in Pichia pastoris by Two-Stage Temperature Induction Strategy

ZHANG Na1，2， LI Jianghua*1，2， JIN Peng1，2， DU Guocheng1，2， CHEN Jian1，2， KANG Zhen1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Hyalurondiases（HAase）are a kind of hydrolases with medicine values.In order to improve the expression of HAase in the recombinant Pichia pastoris，the effect of induction temperature on HAase expressed was investigated in the recombinant P.pastoris.The result showed that the production of HAase could be improved with the decrease of induction temperatures，especially，two-stage temperature induction strategy.In this strategy，temperature was controlled at 25℃during the induction stage 0～60 h，and then shifted to 22℃after 60 h.HAase activity reached to 1.18×106U/mL，2.6 fold improvement compared to induction temperature at 30℃（4.53×105U/mL）.In addition，two-stage temperature induction strategy had an advantage on cell viability and alcohol oxidase activity，which offered a new strategy for expression of exogenous protein in the recombinant P.pastoris.

hyalurondiase，Pichia pastoris，two-stage control temperature，secretion expressed

Q 93

A

1673—1689（2016）12—1273—05

2014-10-10

國家自然科學基金項目（31670092）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2014607）。

*通信作者：李江華（1966—），男，江西修水人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事酶技術發酵過程優化與控制方面的研究。E-mail：lijianghua@jiangnan.edu.cn