影響乳液中β-胡蘿卜素生物可給率的因素研究

梁 蓉， 林全全， 陳 翰， 鐘 芳*

影響乳液中β-胡蘿卜素生物可給率的因素研究

梁 蓉1，2， 林全全1，3， 陳 翰1，3， 鐘 芳*1，3

（1.江南大學 食品膠體與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

為了明確影響乳液體系中β-胡蘿卜素生物可給率的因素，作者通過構建體外消化模型及體外淀粉消化酶、脂肪酶及膽鹽缺失3種特殊消化模型，對以辛烯基琥珀酸（OSA）改性淀粉為乳化劑的β-胡蘿卜素乳液的生物可給率進行研究。結果顯示，不同消化模型中β-胡蘿卜素生物可給率的大小順序為：完整消化模型＞淀粉消化酶缺失模型＞膽鹽缺失模型＞脂肪酶缺失模型。因此，當乳化劑消化、油脂消化和膽鹽膠束化中任一進程被抑制時，乳液中β-胡蘿卜素的生物可給率均降低。且這三者對乳液中β-胡蘿卜素生物可給率的影響程度如下：脂肪消化＞膠束化＞乳化劑消化。

乳液；OSA改性淀粉；乳化劑消化；脂肪消化；膠束化；β-胡蘿卜素；生物可給率

脂溶性營養素，如：β-胡蘿卜素、維生素E、輔酶Q10等，具有提高人體免疫力、延緩衰老、降低心腦血管疾病等保健功能[1]，是人們廣泛關注并青睞的一類食品營養強化劑。然而，此類營養素大多存在水相溶解度低、化學穩定性差的特點[1]，大大限制了它們在食品體系中的添加。基于此，水包油型乳液，因其制備工藝簡單，且成本低，被廣泛應用于此類物質的保護和運輸。大量研究已證明，乳液能有效改善脂溶性營養素的溶解性和穩定性[2-3]。此外，乳化體系還可顯著提高營養素的體外生物可給率[3-4]，但提高程度與乳液中乳化劑和油脂的消化行為以及營養素的膠束化進程有關。

Nik等人[5-6]分別以乳清分離蛋白和大豆分離蛋白為乳化劑制備了β-胡蘿卜素乳液，并發現不同的蛋白質呈現出不同的消化特性，致使這兩種乳液中β-胡蘿卜素的生物可給率也不同。同時，油脂類型不同，載體中營養素的生物可給率往往不同[7-9]；若采用同一類型油相，營養素的生物可給率還與油脂的消化程度相關[7，10]。膠束化被認為是脂溶性營養素被吸收的前提[11]，膽鹽作為混合膠束的主要組成，其含量對膠束化有重要影響，Yi[10]和Wang[12]的研究均表明，β-胡蘿卜素的膠束化率隨著膽鹽含量的增大而增大。

但是，以上結論大都是針對以小分子表面活性劑或蛋白質為乳化劑的體系，當采用淀粉為乳化劑時，其作用機制如何目前尚無定論。因此，作者選用常見的辛烯基琥珀酸（OSA）改性淀粉為乳化劑，以β-胡蘿卜素為脂溶性營養素的代表，制備水包油型乳液，通過構建完整體外消化模型和3種特殊體外消化模型（淀粉消化酶缺失模型，脂肪酶缺失模型和膽鹽缺失模型），對比分析影響以淀粉為乳化劑的脂溶性營養素乳液生物可給率的因素，為構建高生物利用率脂溶性營養素的乳液提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辛烯基琥珀酸 （OSA）改性淀粉 （取代度為1.9%）：宜瑞安食品配料有限公司；中碳鏈甘油三酯（MCT）：益海嘉里投資有限公司；口腔α-淀粉酶（29 U/mg）、胃蛋白酶（474 U/mg）、胰酶（8×USP）、淀粉葡糖苷酶（316 U/mL）、脂肪酶（來源于黑曲霉，約200 U/g）、胰淀粉酶（Type VI-B，≥10 U/mg）：美國Sigma公司；豬膽鹽提取物：美國Sigma公司；氯化鉀、硫氰化鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、尿酸、硝酸鈉，氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；葡聚糖標準品：低重均分子質量系列，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

EL20實驗室pH計：上海梅特勒-托利多有限公司；Allegra 25R臺式高速冷凍離心機：美國貝克曼有限公司；凝膠滲透色譜儀（GPC）：EcoSEC HLC-8320，配置雙通道/雙流路示差（RI）檢測器，日本東曹株式會社；凝膠色譜柱：TSK gel super MultiporePW-M色譜柱，4 μm，6.0 mm×150 mm，日本東曹株式會社；高效液相色譜儀 （HPLC）：配置Waters 1525二元輸液泵，2996 PDA檢測器，美國Waters公司；β-胡蘿卜素測定色譜柱：C30色譜柱，5 μm，4.6 mm×250 mm，美國YMC公司。

1.3 方法

1.3.1 以OSA改性淀粉為乳化劑的β-胡蘿卜素乳液的制備 稱取占乳液總質量分數30%的OSA改性淀粉，溶于去離子水中，并攪拌過夜。將占油相質量分數為0.1%的β-胡蘿卜素溶于MCT油相中，避光攪拌1 h。稱取占乳液總質量分數為10%的MCT油相與OSA改性淀粉水溶液混合，并用高速分散機以18 000 r/min分散4 min，再使用微射流均質機在100 MPa下均質5次，制備得到β-胡蘿卜素乳液，置于4℃避光保藏。

1.3.2 體外消化模型的構建 完整的體外消化模型共包括3個階段，分別為：口腔、胃和小腸。消化液的組成及消化方法如下：

1）口腔階段：根據Hur等人[13]的條件進行適當調整，配制口腔模擬液（SSF），具體組成見表1。將4 mL乳液與4 mL SSF混合，采用1 mol/L HCl調節體系pH至7.0，溫度為37℃，并在100 r/min下攪拌3 min。

2）胃階段：按照Salvia-Trujillo等人的方法[14]，配制模擬胃液 （SGF）。取10 mL SGF加入乳液與SSF的混合物中，調節pH至2.0，在37℃下攪拌（100 r/min）60 min。

3）小腸階段：胃階段結束后，迅速使用（1.0 mol/ L）/（0.1 mol/L）氫氧化鈉將體系的pH調節至7.0，再加入15 mL模擬小腸液（SIF），并采用pH-stat法，通過加入0.2 mol/L氫氧化鈉維持體系的pH為7.0，記錄消化進程2 h內消耗的氫氧化鈉溶液的體積數。

表1 模擬消化液的組成Table 1 Compositions of digestion juices

在完整消化模型的基礎上，通過調整消化酶及膽鹽的添加構建3種特殊消化模型。其中，淀粉酶缺失模型為：SSF中不添加α-淀粉酶，SIF中不添加淀粉葡糖苷酶，添加脂肪酶（活力與胰酶中的脂肪酶相當）代替胰酶；脂肪酶缺失模型為：SIF中添加淀粉酶（活力與胰酶中的淀粉酶相當）代替胰酶；膽鹽缺失模型為：SIF中不添加膽鹽。

1.3.3 消化過程中乳化劑（OSA改性淀粉）重均分子量的測定

1）重均分子量標準工作曲線的確定：將系列低重均分子量葡聚糖標準品溶于流動相 （0.1 mol/L NaNO3，含0.02%NaN3）中，質量濃度為2 mg/mL，并于10 000 r/min下離心5 min，取上層清液，過0.45 μm微孔濾膜。采用GPC系統，結合Super MultiporePW-M色譜柱測定標準品的重均分子量分布，流速為0.6 mL/min，柱溫為35℃，進樣量為20 μL。由EcoSEC數據分析作出重均分子量校正曲線為：lg Mw=-0.008 5t3+0.146 1t2-1.349 6t+10.827，相關系數R2=0.999 5，其中t為保留時間（min），Mw為重均分子量（g/mol）。

2）樣品的測定：分別在口腔和胃消化后以及小腸消化5、20、120 min后取出200 μL樣品，于95℃下滅酶5 min[15]，并用流動相稀釋樣品，使其消化產物質量濃度為5 mg/mL，此后測定同標準品。儀器自動繪出樣品重均分子量分布和Mw等結果，由此監測消化過程中乳化劑OSA改性淀粉重均分子量的變化。

1.3.4 油脂水解率的測定 一般認為一分子甘油三酯可水解產生兩分子游離脂肪酸和一分子甘油單酯[16]。脂肪酸的產生導致pH值降低，通過監控體系消耗NaOH的量可推算出游離脂肪酸的生成量，以游離脂肪酸釋放率表征油脂的消化程度。其中，游離脂肪酸（FFA）的釋放率計算見公式（1）。

式中，FFA為游離脂肪酸的釋放率（%）；mlipid為樣品中油脂的質量 （g）；VNaOH為消化時間t時所消耗的NaOH溶液的體積 （mL）；cNaOH為滴定時選用的NaOH溶液的濃度（mol/L）；Mwlipid為油脂分子的重均分子量（g/moL）。

1.3.5 β-胡蘿卜素生物可給率的測定 消化后取部分消化液在10 000 g條件下離心45 min，樣品分成未消化的油相層、膠束層和沉淀層。用注射器取出混合膠束并過0.45 μm微孔濾膜，采用HPLC測定膠束中的β-胡蘿卜素含量[6]。β-胡蘿卜素的生物可給率計算如公式（2）所示。

式中，BA為β-胡蘿卜素生物可給率 （%）；cmicelles為膠束中β-胡蘿卜素的質量濃度 （μg/mL）；c0為乳液中β-胡蘿卜素的質量濃度（μg/mL）。

1.3.6 數據統計 使用SPSS 17.0軟件進行方差分析，采用Duncan檢驗法（p≤0.05）對實驗數值進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同消化模型中β-胡蘿卜素的生物可給率

首先對乳液經過不同消化模型后的β-胡蘿卜素的生物可給率進行了測定，結果見圖1。在完整消化模型中，乳液的β-胡蘿卜素生物可給率為（31.0± 2.1）%。與之相對比，在脂肪酶缺失模型中，β-胡蘿卜素的生物可給率幾乎為0。在膽鹽缺失模型中，營養素生物可給率低，這與Yi[10]和Wang[12]等人的研究結果一致。在淀粉酶缺失模型中，β-胡蘿卜素的生物可給率也顯著低于完全消化模型。總體來看，4種模型中β-胡蘿卜素的生物可給率大小依次為：完整消化模型＞淀粉酶缺失模型＞膽鹽缺失模型＞脂肪酶缺失模型。

圖1 4種消化模型中β-胡蘿卜素的生物可給率Fig.1 Bioaccessibility of β-carotene in four digestion models

2.2 不同消化模型中乳化劑（OSA改性淀粉）的消化

為了分析引起三種特殊消化模型與完整消化模型后β-胡蘿卜素生物可給率差異的原因，作者進一步對不同消化模型中乳化劑的消化情況進行了表征。圖2顯示了完整消化模型中OSA改性淀粉在不同消化階段的示差信號曲線。由圖2可知，原始OSA改性淀粉的重均分子量分布較寬，經過模擬口腔液（SSF）和胃液（SGF）消化后，OSA改性淀粉的重均分子量分布并沒有發生明顯變化。根據葡聚糖標準曲線，計算得到消化過程中OSA改性淀粉的重均分子量的數值，見表2。經過口腔消化后，OSA改性淀粉的重均分子量略微減小，但不顯著，這可能與SSF中α-淀粉酶活力較低且作用時間短（3 min）有關。進入胃液消化后，淀粉的重均分子量幾乎沒有變化，說明OSA淀粉在酸性條件下較穩定，且未發生分解。但當樣品進入模擬小腸（SIF）消化階段后，淀粉的示差信號曲線發生了明顯的變化。OSA改性淀粉在8～10.72 min左右的洗脫峰信號逐漸降低，且在11 min左右出現了一個新的洗脫峰，根據葡聚糖標準曲線可確定其重均分子量小于500 g/mol，應為淀粉水解的終產物——單糖或二糖。且隨著乳液在SIF中消化時間的延長，該水解產物的洗脫峰強度也隨之增強。為了比較淀粉在腸液消化進程中的水解情況，作者考察了SIF不同消化階段后OSA淀粉分子中出峰時間小于10.72 min的重均分子量（命名為級分1）變化情況，結果見表3。

在完整消化模型中，當乳液進入小腸階段5 min后，淀粉的重均分子量急劇下降，說明此時在胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的作用下，OSA淀粉被迅速水解。此后，隨著消化時間的延長，淀粉的重均分子量仍逐漸減小，但減小速度降低。在SIF中消化120 min后，淀粉的重均分子量為（2 378±90）g/mol，說明此時仍有部分淀粉片段未完全消化。這與文獻報道的OSA淀粉是一種抗性淀粉[17]的消化結果一致。與完全消化模型對比，在脂肪酶缺失模型及膽鹽缺失模型中，OSA淀粉重均分子量的變化與完整消化模型相似，說明在這兩種消化模型中，淀粉的消化并未受到脂肪酶和膽鹽缺失的影響。而在淀粉酶缺失模型中，OSA淀粉的重均分子量在整個小腸消化階段均無顯著變化，因此可推測在此模型中乳化劑的消化完全被抑制。

圖2 完整消化模型中OSA改性淀粉在不同消化階段的GPC色譜圖Fig.2 Chromatograms of OSA modified starches at different stages during the complete digestion model

表2 完整消化模型中口腔、胃消化階段OSA改性淀粉重均分子量變化Tab.2 Changes of weight-average molecular weight of OSA modified starches during digestion in mouth and stomach stages in the complete digestion model

2.3 不同消化模型中油脂的消化

除了乳化劑的消化特性外，油脂的消化情況也被認為是影響脂溶性營養素生物利用率的關鍵因素。作者考察了4種消化模型中乳液在小腸階段游離脂肪酸的釋放曲線，結果見圖3。在完整消化模型中，乳液進入小腸階段后，油脂迅速被水解，在20 min后油脂消化幾乎達到平衡，最終消化率達到95.3%。與此相對應，在脂肪酶缺失模型中，消化液的pH值幾乎沒有變化，即沒有游離脂肪酸生成，表明乳液中油脂的消化因為脂肪酶的缺失而完全被抑制。在膽鹽缺失模型中，油脂的消化速率和程度均低于完整消化模型。這可能是由于膽鹽的缺失會抑制混合膠束的形成，從而使油滴表面聚集了大量的油脂消化產物，進而對油脂的消化產生一定的抑制[18]。在淀粉酶缺失模型中，油脂的消化速率和程度也低于完整消化模型。這說明當乳化劑的消化受到抑制時，液滴表面的OSA淀粉分子可能會阻礙脂肪酶與油滴的接觸，從而抑制脂肪的消化[19-20]。

表3 4種消化模型的小腸階段中OSA改性淀粉中級分1的重均分子量變化Table 3 Changes of weight-average molecular weight of fraction 1 in OSA modified starches during small intestine stage in the four digestion models

圖3 4種消化模型中脂肪酸釋放曲線Fig.3 Released of free fatty acids in the four digestion models

2.4 影響乳液中β-胡蘿卜素生物可給率的機制分析

結合以上4種消化模型中β-胡蘿卜素的生物可給率以及乳化劑和油脂的消化情況可得出，各因素對β-胡蘿卜素生物可給率的影響程度如下：脂肪消化＞膠束化＞乳化劑消化。在脂肪酶缺失模型中，脂肪消化完全被抑制，直接導致β-胡蘿卜素不能從油滴中釋放，使得生物可給率幾乎為零。在膽鹽缺失模型中，膠束化進程受抑制，被釋放的β-胡蘿卜素因缺少膠束載體而結晶析出，生物可給率大大降低。然而，此時由于部分OSA改性淀粉水解產物可形成膠束，用于溶解少量β-胡蘿卜素，使得此時生物可給率不為零。在淀粉消化酶缺失模型中，淀粉消化受到抑制，使得脂肪消化程度降低，β-胡蘿卜素的釋放量減少；同時，脂肪消化產物含量的減少，使得混合膠束對β-胡蘿卜素的溶解能力降低，最終β-胡蘿卜素的生物可給率顯著低于完整消化模型。

基于以上各種條件對消化的抑制作用，可總結以OSA改性淀粉為乳化劑的脂溶性營養素乳液在小腸階段的消化機制，見圖4。具體可分為以下3個階段：1）當油滴表面的乳化劑OSA改性淀粉在淀粉酶的作用下水解后，膽鹽與部分淀粉發生競爭吸附至油水界面，從而減小界面空間位阻，使得脂肪酶更易與油滴接觸，加快油脂水解進程；2）隨著油脂的消化，油脂中的β-胡蘿卜素被釋放，脂肪水解產物（FFA、甘油單酯等）與膽鹽、磷脂形成混合膠束，運載被釋放的β-胡蘿卜素；3）部分未完全消化的OSA改性淀粉發生自膠束化，運載少量β-胡蘿卜素。根據以上消化機制，可以總結脂肪的消化直接控制營養素的釋放；同時，脂肪的消化程度會影響混合膠束的組成，從而影響膠束對營養素的運載能力。而膠束化進程會影響營養素的轉運，從而影響生物利用率。乳化劑的消化情況則是通過影響脂肪的消化，進而影響營養素的釋放和轉運。

圖4 小腸消化階段中OSA淀粉乳液油水界面的消化機理示意圖Fig.4 Digestion processes in the oil-water interface of emulsions stabilized by OSA modified starches in the small intestine stage

3 結語

作者通過對比3種特殊消化模型 （淀粉酶缺失、脂肪酶缺失及膽鹽缺失）與完整消化模型中營養素的生物可給率以及乳化劑和油脂的消化進程結果，探究影響以OSA淀粉為乳化劑的乳液中β-胡蘿卜素生物可給率的因素及機制，得到以下主要結論：乳化劑消化、脂肪消化和膠束化是影響營養素生物可給率的關鍵因素，抑制三者中任意一者，均可降低β-胡蘿卜素的生物可給率；它們的作用機制分別為：脂肪通過控制營養素的釋放和轉運，影響營養素的生物可給率；膠束化通過控制混合膠束的形成，影響營養素的轉運，從而作用于生物可給率；乳化劑通過影響脂肪的消化，從而影響營養素的生物可給率。3種因素對生物可給率的影響程度如下：脂肪消化＞膠束化進程＞乳化劑消化。本研究結論可為構建高效生物利用率的脂溶性營養素乳液，提供一定的指導和幫助。

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Study on the Factors Affecting the Bioaccessibility of β-Carotene in Emulsions

LIANG Rong1，2， LIN Quanquan1，3， CHEN Han1，3， ZHONG Fang*1，3
（1.Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology，Ministry of Education，Wuxi 214122，China；2.School of chemical and material engineering，Wuxi 214122，China；3.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to investigate the parameters affecting the bioaccessibility of β-carotene in emulsion system，in vitro digestion model and three special digestion models（one without starch hydrolases，one without lipase and one without bile salts）were established to investigate the bioaccessibility of β-carotene emulsions stabilized by octenyl succinic anhydride（OSA）modified starches.The results showed that the bioaccessibility of β-carotene in four digestion models reduced in the following order：the complete model＞the model without starch hydrolases＞the model without bile salts＞the model without lipase.It could be concluded that the bioaccessibility of β-carotene would decrease when one of the three processes of starch digestion，lipolysis or micellization of bile salts was inhibited.And the influence degree of these three factors on β-carotene bioaccessibility decreased in the following order：lipolysis＞micellization＞digestion of emulsifiers. Keywords： emulsion，OSA modified starches，digestion of emulsifier，lipolysis，micellization，β-carotene，bioaccessibility

TS 201.7

A

1673—1689（2016）12—1278—07

2015-07-14

國家自然科學基金項目（31401533；31571891）。

梁 蓉（1983—），女，湖北孝感人，工學博士，副教授，主要從事營養素運載體系方面的研究。E-mail：rongliang@jiangnan.edu.cn

*通信作者：鐘 芳（1972—），女，河南新鄉人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品化學和食品膠體方面的研究。E-mail：fzhong@jiangnan.edu.cn