結(jié)核分枝桿菌耐藥分析與基因檢測(cè)分析

黃裕春

[摘要] 目的 探討結(jié)核分枝桿菌耐藥情況及基因檢測(cè)分析。 方法 從2012年3月～2014年3月我院收治的結(jié)核病患者中選取62例為研究對(duì)象，按隨機(jī)數(shù)字法對(duì)患者進(jìn)行分組，首次診治患者39例為觀察組，首次診治失敗后行第二次治療患者23例為對(duì)照組，對(duì)所有患者結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐藥分析及rpsL、rpoB、embB、KatG基因檢測(cè)。 結(jié)果 62例患者中共19例出現(xiàn)耐藥，耐藥率為30.65%，對(duì)照組患者1種藥物耐藥率為26.09%，同觀察組10.26%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2種藥物耐藥率為17.39%，同觀察組7.69%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），3種藥物耐藥率為8.70%，同觀察組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；rpsL、rpoB、embB、KatG基因突變率分別為83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2檢驗(yàn)顯示，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌耐藥的產(chǎn)生同菌株基因具有較大關(guān)聯(lián)，且耐藥率同治療次數(shù)有關(guān)，在結(jié)核病臨床治療中，需根據(jù)患者耐藥情況，選擇聯(lián)合用藥方案，提高治療效果。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分歧桿菌；耐藥；基因；檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R378.911 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）24-213-03

[Abstract] Objective To investigate the analysis in drug resistance of bacteriology tuberculosis and genetic testing. Methods 62 cases of TB patients from March 2012 to March 2014 in our hospital were selected as the objects，and allocated into an observation group and a control group according to the randomly grouping method，first diagnosis and treatment in 39 patients in the observation group，first diagnosis and treatment failure underwent secondary treatment of 23 patients in the control group，all patients were resistant Bacteriology tuberculosis was analyzed and rpsL，rpoB，embB，KatG genetic were tested. Results 62 cases of patients with 19 cases of drug resistance，the drug resistance rate was 1，the control group of patients with 26.09% was compared with the control group（10.26%）， （P<0.05），2 drug resistance rate was 17.39% and 7.69%，the differences were significant （P<0.05），3 drug resistance rate was 8.70%， compared with the observation group， the difference was statistically significant （P<0.05）；rpoB，embB，rpsL，KatG gene mutation rate was 86.11%，88.89%，91.67%，83.33%，x2 test showed no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The generation of drug-resistant Bacteriology tuberculosis strains with genes associated with a larger，and the number of drug-related rates with treatment in the clinical treatment of tuberculosis，to be based drug resistance in patients choose combination therapy programs， improve the therapeutic effect.

[Key words] Bacteriology tuberculosis；Drug resistance；Gene；Detect

重大傳染性疾病對(duì)于人們健康及社會(huì)穩(wěn)定均具有較大危害，因此，對(duì)其進(jìn)行快速診斷歷來(lái)為人類生存發(fā)展所必須。自1882年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌以來(lái)，結(jié)核病便成為嚴(yán)重影響患者健康的重要傳染疾病。世界衛(wèi)生組織1993年稱“全球結(jié)核病處于緊急狀態(tài)”，1998年稱“遏制結(jié)核病行動(dòng)刻不容緩，1999年數(shù)據(jù)顯示[1]，全世界每年因結(jié)核病死亡人數(shù)高達(dá)300萬(wàn)，是其他傳染病死亡人數(shù)之和；世界衛(wèi)生組織（WHO）將結(jié)核病與艾滋病、瘧疾列為21世紀(jì)人類需要攻克的三大傳染性疾病之一。資料顯示[2]，我國(guó)結(jié)核病感染者達(dá)5.5億，發(fā)病率、死亡率和耐藥率均明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家水平。而耐藥結(jié)核的出現(xiàn)，給結(jié)核病的防控與治療增加了難度，本研究對(duì)62例結(jié)合并患者的耐藥情況進(jìn)行分析，結(jié)合基因檢測(cè)方法，對(duì)結(jié)核分析桿菌耐藥原因進(jìn)行分析，為結(jié)核病的防治提供更為科學(xué)的參考依據(jù)。

1 資料與方法endprint

1.1 一般資料

從2012年3月～2014年3月我院收治的結(jié)核病患者中選取62例為研究對(duì)象，男36例，女26例，年齡18～71歲，平均（45.3±3.2）歲，按隨機(jī)數(shù)字法對(duì)患者進(jìn)行分組，首次診治患者39例為觀察組，首次診治失敗后行第二次治療患者23例為對(duì)照組，全部患者均留取痰標(biāo)本，經(jīng)Bactec-960增菌培養(yǎng)與7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)，抽取其臨床分離株為研究材料，并行耐藥檢測(cè)。兩組患者在性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 主要儀器包括：微生物培養(yǎng)箱；生物安全柜；羅氏培養(yǎng)基。藥物包括：鏈霉素（SM）、異煙肼（ING）、乙胺丁醇（EMB）及利福平（RFP）。羅氏培養(yǎng)基作為藥敏試驗(yàn)方法。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的rpoB、KatG基因及rpsL基因突變進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)結(jié)核分枝桿菌野生株序列，設(shè)計(jì)覆蓋rpoB、KatG基因和rpsL基因核心突變區(qū)的系列寡核苷酸探針并將其固定在尼龍膜上，并應(yīng)用生物素標(biāo)記的特異性引物擴(kuò)增包含核心突變區(qū)的基因片段，與固定在膜上的寡核苷酸探針雜交，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行快速檢測(cè)。從62株臨床分離株中挑選36株耐藥株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。

抗性相關(guān)基因的測(cè)序方法：通過(guò)PCR-DS（聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法）對(duì)臨床分離的結(jié)核分歧桿菌的抗藥相關(guān)rpsL、rpoB、embB、KatG基因基因進(jìn)行快速檢測(cè)。同時(shí)，根據(jù)野生株序列，設(shè)計(jì)覆蓋rpsL、rpoB、embB、KatG基因核心突變區(qū)的引物，在經(jīng)PCR擴(kuò)增后，采用測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比，對(duì)突變進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將數(shù)據(jù)納入SPSS17.0軟件中分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，并以率（%）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥分析

62例患者中共19例出現(xiàn)耐藥，耐藥率為30.65%，對(duì)照組患者1種藥物耐藥率為26.09%，同觀察組10.26%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2種藥物耐藥率為17.39%，同觀察組7.69%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），3種藥物耐藥率為8.70%，同觀察組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示治療次數(shù)可增加結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，見(jiàn)表2。

2.2 基因檢測(cè)

62例患者中rpsL、rpoB、embB、KatG基因突變率分別為83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2檢驗(yàn)顯示，經(jīng)不同的抗結(jié)核藥物治療后，rpsL、rpoB、embB、KatG基因突變率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（x2=1.0610，P>0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

重大傳染性疾病對(duì)于人們的健康及生活質(zhì)量具有重大影響，其中，結(jié)核病具有極高的發(fā)生率及危險(xiǎn)性，同艾滋病及瘧疾并列為人類最難攻克的3大傳染性疾病[3]。有報(bào)道顯示[4]，在我國(guó)結(jié)核病發(fā)生率、患者死亡率及病菌耐藥率同發(fā)達(dá)國(guó)家水平相比，均明顯較高，每年近13萬(wàn)結(jié)核病患者死亡。另有研究指出[5]，近年來(lái)由于抗生素的不合理應(yīng)用及耐藥結(jié)核的出現(xiàn)，使得我國(guó)結(jié)核病總耐藥率明顯上升。因此，對(duì)于耐藥及耐多要結(jié)核病的防治，成為臨床研究熱點(diǎn)。鏈霉素（SM）、異煙肼（ING）、乙胺丁醇（EMB）及利福平（RFP）是治療結(jié)合并的一線抗結(jié)核藥物，因此，目前對(duì)于上述藥物的耐藥性分析，一直是研究重點(diǎn)[6]。結(jié)核分歧桿菌耐耐鏈霉素的產(chǎn)生，同其核糖體蛋白S12的編碼基因rpsL的缺失有關(guān)；耐異煙肼的產(chǎn)生，同過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失有明顯關(guān)聯(lián)；而EMB基因突變是耐乙胺丁醇的原因；耐利福平是因核心區(qū)域rpoB基因突變所致[7]。

有學(xué)者指出[8-9]，對(duì)于結(jié)核病致病體的檢測(cè)與耐藥性分析，對(duì)于疾病的防治具有重要意義。關(guān)于治療次數(shù)與耐藥性的關(guān)系，學(xué)界普遍認(rèn)為兩者呈正相關(guān)性，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病復(fù)發(fā)后第二次進(jìn)行治療的患者耐藥率同首次資料患者相比，明顯較高，因此，在臨床治療中，需對(duì)耐藥率進(jìn)行分析，有效指導(dǎo)臨床用藥。本研究中首次診治失敗后行第二次治療的對(duì)照組患者耐藥率同對(duì)首次治療的觀察組比較明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且總耐藥比例略高于國(guó)結(jié)核病總耐藥率，表明患者治療次數(shù)對(duì)于耐藥率有較大影響。以往研究在進(jìn)行耐藥分析時(shí)，未注重患者診治次數(shù)，因此對(duì)于耐藥性的分析缺乏客觀性及準(zhǔn)確性，本研究對(duì)不同治療次數(shù)患者的耐藥率進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)首次診治失敗后行第二次治療患者耐藥率較高，可能同抗結(jié)核藥物的劑量較大，時(shí)結(jié)核分歧桿菌耐藥性增強(qiáng)有關(guān)，因此，在結(jié)核病治療中，需盡量采用科學(xué)方法，縮短療程，預(yù)防復(fù)發(fā)，減少病菌耐藥性。同時(shí)，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，多種藥物聯(lián)用，患者耐藥率較低，表明在結(jié)核病治療中，采用聯(lián)合用藥方法，可有效提高治療效果。

在以往較長(zhǎng)時(shí)間，比例法及絕對(duì)濃度法是結(jié)核分枝桿菌耐藥性的常用測(cè)定方法，但有學(xué)者認(rèn)為[10-11]，采用上述方法，耐藥性測(cè)定時(shí)間達(dá)到6～8周，甚至需要更長(zhǎng)時(shí)間，不能對(duì)臨床治療進(jìn)行及時(shí)指導(dǎo)。近年來(lái)由于分子生物技術(shù)取得了明顯進(jìn)步，分枝桿菌耐異煙肼、耐利福平、耐鏈霉素及耐乙胺丁醇的相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。有學(xué)者[12]通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)臨床分離株rpsL、rpoB、embB、KatG基因突變進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥株rpsL、rpoB、embB、KatG基因突變率較高，接近90%，本研究中上述耐藥株的基因突變率分別為83.33%、86.11%、88.89%與91.67%，結(jié)果同相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。表明采用PCR技術(shù)對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的靈敏性與特異性。

盡管PCR技術(shù)在耐藥基因檢測(cè)中具有較高價(jià)值，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，PCR技術(shù)實(shí)踐中也存在一些問(wèn)題，如需要對(duì)病原體進(jìn)行培養(yǎng)和專門的PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，且操作較為繁瑣，易出現(xiàn)交叉污染。有研究表明[14]，采用恒溫核酸擴(kuò)增法（LAMP）技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)，不僅具有同PCR技術(shù)一致的高特異性與靈敏性，且不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性，同時(shí)，該技術(shù)還具有快速、高效擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)。有學(xué)者[15-16]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和原位熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在疾病靶基因六個(gè)區(qū)域的特異引物進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，最后通過(guò)顏色變化判讀結(jié)果，避免了 PCR 對(duì)儀器的依賴；僅需要水浴鍋即可，大大降低了使用成本；檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、不依賴儀器設(shè)備，特別適用于基層社區(qū)和農(nóng)村廣大人民群眾的健康需求，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益。endprint

綜上所述，對(duì)結(jié)合分歧桿菌耐藥性進(jìn)行分析，對(duì)于結(jié)核病臨床治療與疾病的預(yù)防控制具有重要指導(dǎo)作用，PCR及LAMP技術(shù)對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)均具有較好效果。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 洪創(chuàng)躍，劉小立，桂靜，等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌pncA基因突變特征及與吡嗪酰胺耐藥相關(guān)性研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46（5）：436-439.

[2] M，Arjomandzadegan，P，Owlia，R，et al.Rapid and simple approach for identification of Mycobacterium tuberculosis and M. bovis by detection of regulatory gene whiB7[J].Acta microbiologica et immunologica Hungarica，2011，58（1）： 65-74.

[3] 許蘊(yùn)怡，譚耀駒，易小萍，等.臨床分離結(jié)核分枝桿菌耐藥性質(zhì)與rpoB、rpsL基因變異的研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（18）：3131-3133.

[4] 胡族瓊，蔡杏珊，謝偉勝，等.吡嗪酰胺耐藥結(jié)核分枝桿菌pncA及rpsA基因突變特征分析[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（4）：285-289.

[5] Lin，Zhibing，Zhang，et al.Comparison of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis[J].Veterinary Parasitology，2012，185（2/4）：296-300.

[6] 李華，李楓，梁海燕，等.結(jié)核分枝桿菌耐藥株與敏感株Ag85B表達(dá)的差異[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（5）：657-659.

[7] 楊輝，張國(guó)良，張明霞，等.某地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（34）：3591-3593.

[8] Malele，I.I.，Ouma，J.O.，Enyaru，J.C.K.，et al.Comparative diagnostic and analytical performance of PCR and LAMP-based trypanosome detection methods estimated using pooled whole tsetse flies and midguts[J].Veterinary Parasitology，2013，197（3）：549-556.

[9] 鄭曉靜，杜博平，賈紅彥，等.結(jié)核分枝桿菌對(duì)氨基水楊酸耐藥相關(guān)基因的篩選及鑒定[J].北京醫(yī)學(xué)，2012，34（9）：783-786.

[10] 王永忠，朱珉之，劉小琴，等.結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)及臨床應(yīng)用[J].中華傳染病雜志，2012，30（11）：696-699.

[11] 楊健，逄宇，趙雁林，等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)環(huán)絲氨酸、對(duì)氨基水楊酸的耐藥性及其與基因型關(guān)系分析[J].中國(guó)防癆雜志，2015，37（2）：122-127.

[12] 張瀝月，胡屹，吳琳琳，等.耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌對(duì)耐多藥結(jié)核病流行的影響[J].中華傳染病雜志，2015，33（3）：159-163.

[13] 蔡闖，鐘南山.結(jié)核分枝桿菌及多重耐藥性的快速檢測(cè)：MTB/RIF實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)診斷系統(tǒng)[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（10）：998-1002.

[14] Sowmya，N，Thakur，M.S，Manonmani，H.K.et al.Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic <；i>；Staphylococcus aureus<；/i>；directly from food samples：comparison of PCR and LAMP methods[J].Journal of applied microbiology，2012，113（1）：106-113.

[15] 柳清云，羅濤，李靜，等.雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物耐藥相關(guān)基因突變[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，36（1）：63-67.

[16] 梅早仙，冀萍，吳琦，等.牛結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌鑒別方法的研究現(xiàn)狀[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2015，38（5）：387-389.

（收稿日期：2015-09-09）endprint