分子標記技術及其在大麥遺傳育種中的應用

余　 其，王振波，沈真輝，李應秋

(1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.福建省農科院作物研究所，福建 福州350000)

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分子標記技術及其在大麥遺傳育種中的應用

余 其#1，王振波#2，沈真輝1，李應秋1

(1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.福建省農科院作物研究所，福建 福州350000)

摘要：大麥是世界上栽培最古老的糧食作物之一，也是十分重要的飼料和釀酒原料。分子標記技術不受環境和季節限制，具有多態性高、信息量大、穩定性好等優勢，已被廣泛應用于大麥遺傳育種。本文綜述了分子標記主要類型、基本原理及優缺點，并介紹了近年來分子標記技術在大麥分子遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性研究、種質資源鑒定、目標基因定位、起源與進化關系、分子標記輔助選擇研究等方面的應用。

關鍵詞：大麥；分子標記；遺傳育種

大麥是世界上居于小麥、水稻、玉米之后的第4位重要的谷類作物，也是十分重要的飼料和釀酒原料[1]。大麥含纖維素、抗氧化成分，富含膽固醇生物合成抑制劑等，營養十分豐富，并且低糖低脂肪，在醫療保健食品開發等方面日益受到世界各國的重視。利用高產、優質、抗病的種質資源，創造大麥理想株型，突破產量屏障，開展大麥超高產優質育種，已成為近年來大麥育種家關注的熱點。以前常規的育種方法已不能滿足育種家的需要，近年來，分子標記通過提供準確、可靠、穩定的DNA水平的遺傳標記，已在大麥遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性研究、目標基因定位及起源關系進化研究等方面得到了廣泛應用。

1分子標記特點及主要的分子標記

分子標記可直接反映生物體基因組DNA間的差異。分子標記很少受表現型影響，相對于形態學標記有如下特點：①不受環境及季節限制，不受試驗材料部位的影響，而形態標記通常表達于特定的環境和一定的組織；②具有較高的遺傳多態性，信息量大；③大多數標記為中性標記，群體的表型不會對其發生較大的改變；④顯隱性互作情況不存在；⑤不受環境影響，同時也不存在上位效應[2]；⑥數量極多，遍及整個基因組；⑦大多分子標記能表現出共顯性，可鑒定純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息；⑧同一套基因可以用于不同的物種[3]；⑨引物可隨機設定，便于在物種中檢出大量的DNA多態性；⑩操作簡單快速。目前分子標記大致分為3大類型：①基于雜交的分子標記；②基于PCR的分子標記；③基于DNA序列和芯片的分子標記。

1.1 以分子雜交技術為基礎的分子標記

限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)是利用特定的限制性內切酶酶解基因組總的DNA，用特異性探針進行Southern雜交，通過放射自顯影檢測DNA多態性，該標記為共顯性標記。RFLP的優點：①RFLP標記可靠性高；②具有共顯性，可區分純合和雜合；③無表型效應，不受發育階段及器官特異性限制；④遍布于整個基因組，在數量上幾乎不受限制。RFLP應用很多，但也有一些缺點：①具有種屬特異性，在實際應用中受到限制；②需要儀器設備較多，技術也較為復雜；③DNA需求量大(5～10μg)，純度要求高；④多態性水平低。因此，RFLP應用受到一定限制。

1.2 以PCR技術為基礎的分子標記

隨機擴增多態性DNA(Random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)標記的引物長度約10個堿基，先隨機擴增基因組DNA，然后用凝膠電泳檢測DNA序列多態性。其優點是：①不需DNA探針，設計引物也不需要知道序列信息，一套引物可用于不同生物的基因組分析；②無放射性，操作非常簡單；③只需少量DNA 樣品，對DNA質量要求不高；④引物沒有嚴格的種屬界限，具有廣泛性和通用性。RAPD是顯性標記，因此無法在F2代中鑒定基因型是純合型還是雜合型。RAPD重復性差，PCR條件改變都會影響擴增結果。改善RAPD的反應體系，能在一定程度上提高RAPD的重復性。

擴增片段長度多態性(Amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)通過限制性核酸內切酶雙酶切割基因組DNA，針對不同材料酶切片段差異，利用選擇性堿基引物來進行PCR，以及聚丙烯酰胺凝膠電泳來實現對產物的分離，通過放射性同位素的方法以及銀染熒光染色獲取目的圖譜，并進行多態性判斷。AFLP具有較高的分辨率，對模板純度要求較高。產生的標記可覆蓋整個基因組。AFLP多態性高，DNA用量少，它既有RFLP的可靠性，又有RAPD的高效性，但試驗費用較高，操作難度大。盡管如此，AFLP是至今認為最有效的分子標記技術，在種質資源鑒定以及遺傳多樣性檢測和物種親緣關系分析中有著非常廣泛的應用。

序列標簽位點(Sequence tagged site，簡稱STS)是基因組上一段長度多在200～500bp之間的單拷貝短DNA上特定序列片段，這種序列通常會在染色體上只出現1次，利用1對寡聚核苷酸引物對基因組進行PCR，從而可以作為基因組中的特異位點，以此來判斷DNA方向和其他特定序列的相對位置。STS的特點是操作簡單，多態性好，信息量大。

簡單重復序列多態性(Inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)，其原理是：在SSR序列基礎上，在微衛星DNA序列的3′端或5′端加上2～4個隨機核苷酸作為錨定引物，進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的產物。ISSR標記為顯性遺傳，操作簡單、快速、花費低，只需少量模板DNA，與SSR標記相比不需要知道靶序列的信息背景，結合了RAPD標記和SSR標記的優點，同時比以上標記更具多態性。然而，由于ISSR標記是顯性標記，故未能計算雜合度與父系分析等問題，但ISSR技術快捷、經濟、易操作，尤其適用于大批樣品的研究。

序列特征化擴增區域(Sequence characterized amplified region，簡稱SCAR)由RAPD標記技術進一步發展而來。其原理是：通過對RAPD產物進行克隆與測序，在原RAPD引物的3′和5′端各添加14個堿基，來擴增其DNA片斷，以產生多態性片斷。SCAR標記克服了RAPD標記重復率差、可靠性低等缺點，不僅具有RAPD的顯性特征，還可以將其顯性特征轉化為共顯性。目前通過將RAPD標記轉化為SCAR標記，可以大大提高試驗準確率。

相關序列擴增多態性(Sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)針對基因外顯子中GC豐富,而啟動子、內含子里AT豐富的特點來設計引物，它包括17個堿基的正向引物和18個堿基的反向引物，以對開放讀碼框進行擴增。因不同個體中內含子、外顯子和其間隔長度不同而產生多態性。該標記特點是多態性高、重復性好、操作簡單，引物具有通用性且引物合成成本較低。

簡單重復序列(Simple sequence repeat，簡稱SSR)是由幾個堿基組成的串聯重復序列。由于重復序列的突變率較高，從而產生了很多等位基因，使SSR具有高度的多態性。SSR標記對DNA需求量少，質量要求低，容易檢測，共顯性遺傳，多態性高，結果穩定可靠，重復性好，操作及分布于整個基因組，數量豐富，在遺傳多樣性研究、種質資源的鑒定、遺傳圖譜構建以及基因定位中有著廣泛的應用。但是，SSR引物具有高度種屬特異性，獲得新SSR引物費用高，難度大。SSR富集文庫的構建和SSR-EST的發展可以使SSR標記在大麥遺傳育種中發揮更大的作用。

1.3其他新型分子標記

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，簡稱SNP)是由于單堿基的缺失、插入、轉換和顛換而引起基因組水平上的DNA序列多態性。SNP標記位點分布廣泛，同時遺傳穩定性高以及具有檢測快速、易實現自動化等特點。目前，SNP已成為生物學研究的熱點。與其他類型的分子標記相比，SNP標記更適合數目龐大的檢測分析。

多樣性微陣列技術(Diversity arrays technology，簡稱DArT)，該技術依賴于微陣列芯片雜交的基礎，一個陣列可同時檢測分布在基因組中的幾百個多態性位點。點陣列中每個點代表不同樣本基因組的DNA片段，其中包括僅個別樣本可具備的特異性片段。因不同樣本的基因組DNA序列存在差異，故與芯片上同一點序列雜交的效率不一致，只有與探針DNA互補的點才具有雜交信號，在 DArT多樣性分析中表現不同雜交信號強度或有無的點就是一個 DArT標記(DArT marker)，也是基因組代表中的一個多態性片段。DArT技術的主要優點是高通量低成本，缺點在于準確性不夠高，重復性低，分辨率易受影響等，但其芯片制作、雜交、結果掃描和計算機分析的平臺體系則有利于育種工作走向自動化與實用化，并可通過網絡進行資源共享。

插入/缺失多態性標記(Insertion/deletion, 簡稱InDel)。該標記的多態性相對SSR要小，帶型簡單，分布較密，因此用于遺傳分析或基因診斷的重現性、準確性和分辨率也大為提高，很適合遺傳圖譜的構建與基因定位分析。該標記在基因精細定位與染色體步移等多個領域具有較廣闊的研究前景。

2分子標記在大麥遺傳育種中的應用

2.1用于構建分子遺傳圖譜

分子遺傳圖譜是基因圖位克隆、目標基因定位和分子標記輔助育種等研究的基礎。圖譜標記數多且分布均勻，那么基因定位就更精細[4]。大麥第1張分子標記遺傳連鎖圖是Heun(1991)建立的，其群體為Proctor×Nudika雜交F1花藥培養獲得DH群體(共113株系)，包含157個RFLP標記[5]。此后，AFLP、SSR、STS、SNP、SRAP分子標記也逐漸被用于構建連鎖遺傳圖譜。Prada等(2004)利用AFLP、SSR、STS農藝性狀標記構建了包含147個標記的遺傳圖譜，其連鎖群覆蓋的總長為1 125 cM，標記的平均距離為7.5 cM[6]。Wenzl等(2004)以SSR、RFLP、STS和DArT標記構建了一張高密度遺傳連鎖圖，并且把2 085個DArT整合到該圖譜中[7]。郭蕾蕾(2012)利用SSR和SRAP標記篩選95對SSR標記和38對SRAP標記，共產生181個多態性位點，并構建連鎖遺傳圖譜。該圖譜包括102個SSR多態性位點及69個SRAP多態性位點，171個標記分布于全部7條大麥染色體上，分配到9個連鎖群，總長度為1 424.2cM，標記間的平均距離為8.33cM[8]。孫紅艷(2014)采用大麥耐鎘性不同的親本雜交F1構建DH群體為材料，利用SSR和SNP構建大麥遺傳圖譜，圖譜總長度為369.9 cM，共包含56個標記，各個標記被定位于大麥7條染色體上，其中SSR標記41個，SNP標記15個，標記間平均距離為8.1cM[9]。Zhou等(2015)利用SNP標記構建遺傳圖譜，共有12 998個SNP標記被定位在7個連鎖群，圖譜總長度為967.6cM[10]。李媛媛等(2014)發現SRAP引物產生的多態性位點比SSR、AFLP多，SRAP更適合大麥遺傳連鎖圖譜構建[11]。

2.2用于遺傳多樣性及種質資源鑒定

在大麥雜交育種中，選用遺傳差異大的親本對培育優良新品種具有重要意義。同時，根據遺傳多樣性結果對種質進行聚類分析，可以了解物種的系統發育、親緣關系及起源。Russell等(1997)用RFLP、AFLP、SSR、RAPD 4種分子標記對18個栽培大麥的遺傳多樣性進行比較，發現SSR標記獲得的多態性信息量最高[12]。Hou等(2005)利用RAPD和ISSR標記分析了中國西部16個大麥種質資源的遺傳多樣性，結果表明RAPD標記平均遺傳相似系數為0.864，ISSR標記平均遺傳相似數為0.674[13]。趙春燕等(2010)用42對SSR引物對42份大麥品種(系)的種質多樣性及親緣關系進行了分析，結果表明這些大麥基因型的遺傳相似數的變化較小，且大麥地方品種遺傳背景相對復雜[14]。賴勇等(2013)利用86個SSR標記對113份大麥親本材料進行遺傳多樣性分析，檢測出200個等位變異，遺傳相似系數變異范圍在0.550 4～0.989 7間，平均值為0.747 7[15]。Wang等(2014)利用71個SSR標記對99份大麥親本材料進行遺傳多樣性分析，檢測出184個等位變異。聚類分析表明，遺傳相似系數范圍從0.510 9～0.951 1，平均為0.720 2。根據遺傳相似性系數可以將材料聚為5類。SSR標記的高多態性特點較其他分子標記更能揭示出作物遺傳多樣性[16]。

2.3用于重要性狀基因定位

優良基因的鑒定和利用是大麥遺傳育種的先決條件，分子標記技術的發展為定位大麥重要性狀基因提供了一個有效的途徑。Graner 等(1993)利用RFLP標記將抗大麥溫型黃花葉病毒(BaMMV)基因定位在3H染色體長臂上[17]。Feng等(2004)將裸大麥分枝穗突變體(自發突變)中發掘的穗發育bm定位在大麥4H染色體短臂上[18]。張京(2003)通過SSR標記把我國大麥矮源品種所攜帶的基因uz定位在染色體3H上的HVM33和HVM60之間，遺傳距離大約分別只有3.4cM和10.6cM[19]。Huang等(2011)將從多棱皮大麥分枝突變體(Prbs)中發掘的分枝穗發育Prbs基因定位在大麥3H染色體短臂上[20]。金婷將白化穎殼基因定位在3H上的Bmag0508A和Bmac0871之間，遺傳距離分別為0.2cM和0.7cM[21]。對目標基因的定位和克隆可以進一步分析目標基因的功能。

2.4 用于闡明起源與進化關系

分子標記在作物的起源以及進化上的研究已非常成熟，目前該方面的報道較多。Melchinger等(1994)利用RFLP對歐洲大麥種質的48份春、冬大麥品種間的遺傳多樣性進行了分析，得出春大麥和冬大麥可以根據遺傳相似系數劃分為獨立兩組[22]。Ivandic(2002)等用圖譜位置已知的33個SSR標記對來自以色列、土耳其和伊朗的39份野生大麥進行研究，發現大多數野生大麥能根據其起源的國家進行歸類[23]。Feng等(2005)利用SSR標記西藏野生大麥的遺傳多樣性和地理分化進行相關研究，推測西藏野生二棱大麥可能是中國栽培大麥的祖先，進化關系為：野生二棱大麥→野生瓶形大麥→野生六棱大麥[24]。張鏑(2007)等構建了36份西藏近緣野生大麥和4份栽培大麥的AFLP指紋圖譜，發現近緣六棱大麥和栽培大麥親緣關系更近，認為野生六棱大麥是栽培大麥進化的過渡類型[25]。

2.5用于分子標記的輔助選擇

選擇是作物育種的重要環節。通過連鎖標記，間接性的選擇作物目標性狀，能夠提高選擇效率。大麥遺傳育種中運用分子標記輔助選擇的技術已經較為常見。Graner等(1999)通過CAPS標記和SSR標記分析了抗黃花葉病基因rym5，認為rym5是復合位點，鑒定的兩側分子標記MWG838和Bmac29，距該位點遺傳距離分別只有0.8cM和1.3cM[26]。趙彥宏等(2011)利用Yd2基因緊密連鎖的YLM、CAPS-Ylp、ASPCR-Ylp標記同時檢測52份國內外大麥品種和4份大麥F1的Yd2基因型，可用于Yd2基因回交育種中的大規模標記輔助選擇[27]。

3展望

分子標記應用研究快速發展，使得植物學分類和遺傳多樣性等方面的研究取得了重大成就。但是，我國的大麥分子標記育種技術還遠遠落后于國際水平，還需將常規育種與分子標記技術進行結合，才能夠及時有效地發現并利用種質資源中的有利變異。同時，與我國的實際情況相結合，應將科研的重點放在大麥的品質與產量性狀上，使我國的大麥育種技術在重點方向上不斷取得進展。

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Molecular Marker Technologies and their Applications to Barley Genetics and Breeding

YU Qi1, WANG Zhen-bo2, SHEN Zhen-hui1, LI Ying-qiu1

(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China.2. Crop Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350000, China)

Abstract:Barley is one of the most ancient crops cultivated in the world and also a very important feed grain and industrial material for beer brewing. In recent years, molecular marker technologies that can provide accurate and reliable DNA genetic markers have been widely applied to barley breeding and genetic studies. This review describes molecular markers in terms of their general characteristics, rationales, advantages, and disadvantages. This paper also illustrates the molecular marker technologies that have been applied to barley genetics and breeding research in recent years, particularly in barley genetic diversity, gene mapping, construction of genetic map, varietal identification, purity assessment, and marker-assisted selection.

Key words:Barley; Molecular marker; Genetics and breeding

收稿日期：2016-04-07

基金項目：國家自然科學基金項目(41460385)。

作者簡介：#共同第一作者。余其 (1988—) ，女，碩士研究生，主要從事麥類植物分子遺傳與育種研究。E-mail:18725187672@163.com。 王振波(1989—)，男，碩士研究生，主要從事植物資源的研究與利用。E-mail:754977774@qq.com。

中圖分類號：S512.3；Q754

文獻標識碼：A

文章編號：1673-6486-20160174

網絡出版時間：2016-05-05

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20160505.1137.001.html