兔膝OA腔內注射牛膝多糖對軟骨細胞凋亡的影響

邱蕓 姜勇 梅芳

【摘 要】 目的：探討關節腔內注射牛膝多糖液對骨性關節炎軟骨細胞凋亡率的影響。方法：造模成功后，實驗兔左側膝關節腔內注射牛膝多糖液0.4ml，右側膝關節內注入玻璃酸鈉0.4ml，每周1次，共4次。于0、15、30d各處死12只實驗兔，觀察軟骨細胞凋亡及凋亡率。結果：治療前各組細胞凋亡率比較無明顯差異（P>0.05）；治療第15天各組與治療前比較差異均有統計學意義（P<0.05），兩組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；治療第30天各組與治療前比較差異均具有統計學意義（P<0.05），兩組間差異有統計學意義（P<0.05）。結論：牛膝多糖能夠更好的促進骨性關節炎修復，具有很好的臨床價值。

【關鍵詞】 牛膝多糖；膝骨關節炎；軟骨細胞；凋亡率

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）22-0014-02

骨關節炎是一種退行性骨關節病，以關節軟骨退變及軟骨下骨變化為主要特征[1]。骨關節炎發生以膝、髖部最為常見，且在60歲以上中老年人群的膝骨關節炎發病率高達49%[2]。研究分析關節腔內注射牛膝多糖液對玻璃酸鈉骨性關節炎軟骨細胞凋亡率的影響，探討牛膝多糖對骨性關節炎的作用，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康6～8月齡新西蘭雄性大白兔36只，體重2.0kg左右，由南昌大學醫學院動物科學部提供。動物合格證號：江西醫動證字第04106-01號，SPF級。

1.1.2 儀器與試劑 XYS-13型熒光顯微鏡（上海上光新光學科技有限公司）；CCK-8-1000T型細胞周期與凋亡試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司）。

1.1.3 藥品 中藥懷牛膝（江西中醫藥高等專科學校附屬醫院中藥房提供并鑒定）。粉碎過目，放入多功能提取罐，先加入蒸餾水400 L提取2次，藥物殘渣再加蒸餾水300L提取2次；提取液合并濃縮，然后加入3倍量乙醇進行純化，得白色沉淀物，沉淀經干燥得牛膝多糖粗提物，進一步使用乙醇純化，得牛膝多糖純化物；將純化物配成相當生藥4 g的水溶液放冰箱備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 動物進行左右側造模膝骨性關節炎，左膝為治療組，右膝為對照組。

1.2.2 造模 采用改良Hulth模型造模，取符合要求的36只雄性新西蘭白兔，用3%戊巴比妥鈉以30mg/g劑量對動物耳緣靜脈注射麻醉，固定于手術臺上，雙膝關節局部脫毛，備皮，消毒，關節內側進行長4cm左右縱切口，切斷內側副韌帶，摘除內側半月板，切斷前交叉韌帶，保留后交叉韌帶，保護軟骨面，徹底止血，清理縫合及固定。術后1周內每天強迫動物進行30min超疲勞活動，共觀察3個月。然后進行X線觀察顯示有明顯的關節腔狹窄及骨刺形成，以獲得骨性關節炎模型[3]。

1.2.3 給藥 造模成功后的第1天，實驗左側膝關節腔內注射治療物牛膝多糖液0.4ml，右側膝關節內注入對照藥物玻璃酸鈉0.4ml，每周1次，共4次。實驗的第0、15、30天分別處死12只試驗兔，取材后進行軟骨細胞凋亡觀察，并觀察動物的日常總體狀況，測量體重，并作相關記錄。

1.2.4 觀察指標及方法 將關節軟骨組織冰凍切片后，用4%多聚甲醛溶液在室溫下固定20min，然后加入細胞通透液（0.1%TritonX-100+0.1%枸櫞酸鈉）后加入PBS液洗2次，擦片后加入50μl TUNEL反應混合液，在37℃溫箱內加蓋孵育60min，PBS洗3次后，置于熒光顯微鏡下觀察（見圖1），有熒光顯色者可確認為具有細胞凋亡特征。放大400倍進行觀察，以100個軟骨細胞為單位，計算凋亡的數目統計細胞凋亡率。平均每切片觀察5個視野，統計其平均凋亡率。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS11.0統計軟件分析，計量資料以均數加減標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計意義。

2 結果

治療前兔軟骨細胞凋亡率差異不具有統計學意義（P>0.05）；治療第15天各組與治療前比較差異均具有統計學意義（P<0.05），但治療組間差異無統計學意義（P>0.05），說明牛膝多糖與玻璃酸鈉治療兔膝骨關節炎都有效，兩者效果無明顯區別。治療第30天與治療前比較差異均具有統計學意義（P<0.05），且治療組間比較差異具有統計學意義（P<0.01），說明牛膝多糖與玻璃酸鈉治療效果有明顯區別，且牛膝多糖優于玻璃酸鈉。見表1、圖1。

3 討論

《本草綱目》記載牛膝“苦、酸，平，無毒。治…傷折。牛膝乃足厥陰、少陰藥。所主之病，大抵得酒則能補肝腎，生則能去惡血”?！侗窘洝贩Q其“治寒濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸，逐血氣，…久服輕身耐老”。牛膝多糖是牛膝中含量較高的活性成分，藥理研究證明，牛膝多糖在調節免疫、抗衰老等[4]方面活性顯著。張利等[5]運用補腎活血湯治療膝骨性關節，顯示補腎活血湯（包括牛膝）對膝關節骨性關節炎引起的關節疼痛有明顯的療效；陳元娜[6]研究發現川牛膝多糖高劑量組有促進細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫功能的作用，表明牛膝多糖具有一定增強免疫功能的作用。另外，牛膝多糖對糖尿病大鼠視網膜病變具有保護作用[7]；牛膝對重型顱腦損傷大鼠神經干細胞的再生有促進作用[8]。

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）嚴重程度和軟骨細胞凋亡數量之間存在著重要的相關性[9]，OA中凋亡軟骨細胞的比例增高，說明在0A中細胞凋亡的確在發揮作用[10]。本實驗研究結果顯示牛膝多糖對兔OA軟骨細胞凋亡有正向調節的作用，可以減少細胞的凋亡率，這可能是牛膝多糖能夠促進骨性關節炎修復的機制，說明牛膝多糖對于防治OA具有很好的臨床應用價值。

參考文獻

[1]Zamli Z，Sharif M.Chondrocyte apoptosis：a cause or consequence of osteoarthritis [J].Int J Rheum Dis，2011，14（2）：159.

[2]何永淮，孫劍.車濤，等.二號敷藥外敷治療膝骨性關節炎60例的臨床研究[J].現代生物醫學進展，201l，1（4）：745.

[3]熊元，趙振國，李傳郡，等.兔膝骨關節炎模型的制備及鑒定[J].實驗動物科學，2013，30（3）：31-35.

[4]李金貴，谷文英，劉傳敏，等.牛膝多糖對環磷酰胺致小鼠免疫抑制作用的影響[J].中國獸醫雜志，2011，46（4）：24-26.

[5]張利，寇久社，張鴻，等.補腎活血湯治療膝骨性關節炎療效觀察[J].陜西中醫，2012，33（8）：1002-1003.

[6]陳元娜，徐錦龍，陳武，等.川牛膝多糖對小鼠免疫功能影響的實驗研究[J].海峽藥學，2012，24（6）：17-18.

[7]楊旭東，張杰，包?；?牛膝多糖對糖尿病大鼠視網膜細胞凋亡的影響[J].中國中醫眼科雜志，2011，21（1）：8-10.

[8]韋相蘭，黃李平，李凱，等.懷牛膝對重型顱腦損傷大鼠腦組織Nestin表達的影響[J].四川醫藥，2011，29（5）：59-61.

[9]Hashimoto S，Nishiyama T，Hayashi S，et al.Role of p53 in human chondrocyte apoptosis in response to shear strain [J].Arthritis Rheum，2009，60（8）：2340-2349.

[10]Carame s B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its agingrelated loss is linked with Cell death and osteoarthritis [J].Arthritis Rheum，2010，62（3）：791-801.

（收稿日期：2015.08.06）