正交試驗優(yōu)選玉女煎多糖提取工藝研究

李生茂　劉琳 陳珍　王彪　萬章平　陳小云

【摘 要】 目的：探索玉女煎多糖提取的最佳方法。方法：采用苯酚-硫酸顯色測定玉女煎多糖的含量，采用L9（34）正交試驗考察提取溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)對玉女煎多糖提取的影響，并確定多糖最佳提取工藝。結果：玉女煎最佳提取工藝為12倍量的蒸餾水回流提取3次，每次30min。結論：該工藝穩(wěn)定可行，可用于玉女煎多糖的提取。

【關鍵詞】 玉女煎；多糖；正交試驗；苯酚-硫酸法

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）22-0017-02

玉女煎首載于《景岳全書》[1]：“生石膏三、五錢，熟地三、五錢或一兩，麥冬二錢，知母、牛膝各錢半，水一鍾半，煎七分，溫服或冷服”，用于“治水虧火盛，六脈浮洪滑大，少陰不足，陽明有余，煩熱干渴，頭痛，牙疼，失血等癥”。玉女煎為滋陰潤燥的代表方之一，臨床常以其為基本方加減治療糖尿病及并發(fā)癥[2-7]，并取得良好效果。藥理研究[8-10]證實，玉女煎及其加減對多種糖尿病動物模型有降血糖的作用、方中熟地[11-12]、麥冬[13-16]、知母[17-18]和牛膝[19-23]藥材均含多糖類成分，且具有降血糖作用。實驗采用正交實驗設計優(yōu)選了玉女煎多糖提取工藝，并采用硫酸-苯酚比色法測定其含量，以期為玉女煎多糖降血糖作用進一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津1750紫外分光光度計（日本島津公司）；HH-2K4型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；UP HW-IV-90T純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；Ohaus Discovery十萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）。

1.2 材料 熟地黃、石膏、麥冬、知母、牛膝均購于南充市便民大藥房，經(jīng)川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院李毅主任藥師鑒定，均符合2010年版中國藥典標準；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 標準溶液的制備 取干燥至恒重的葡萄糖對照品適量，精密稱定，加蒸餾水配制成濃度為0.2mg/ml的葡萄糖對照品儲備溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的制備 取玉女煎（按石膏∶地黃∶麥冬∶知母∶牛膝比例為15∶30∶6∶5∶5組方）約1g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入12ml蒸餾水，稱定重量，回流提取3次，每次30min，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補足減失的重量，搖勻，濾過，合并三次濾液，即得。

2.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取葡萄糖對照品儲備溶液0.5、1、1.5、2、2.5ml置10 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液2ml，加入1ml 6%的苯酚溶液，再加入5ml硫酸，90℃顯色40min，取出，流水快速冷卻至室溫。以蒸餾水2ml按上述條件處理的溶液作為空白，在490nm處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程：A=11.671C+0.0665（R=0.9993）。結果表明，葡萄糖濃度在10～50μg/ml范圍內(nèi)的線性關系良好。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取玉女煎約1g，精密稱定，按“2.1”制備供試品溶液，按“2.2”項下方法測定吸光度值，重復測定6次，吸光度值RSD為0.82%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取玉女煎6份，每份約1g，精密稱定，按“2.1”制備供試品溶液，按“2.2”項下方法測定吸光度值，吸光度值RSD為4.15%，表明方法的重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液按“2.1”項下方法顯色后，分別在0、15、30、45、60 min 5個時間點測定吸光度，吸光度值的RSD為2.64%，表明樣品在1h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率試驗 取玉女煎5份，每份約0.5g，精密稱定，每份加入20mg葡萄糖，按“2.1”制備供試品溶液，按“2.1”項下方法測定吸光度值，計算回收率。結果表明葡萄糖的平均回收率為97.62%，RSD為3.98%。

2.4 正交試驗 以多糖為指標，選用L9（34）正交表對提取次數(shù)（A）、提取時間（B）和提取溶劑用量（C）3個主要因素進行考察，每個因素擬設3個水平，見表1。按正交實驗表1條件對玉女煎中多糖類成分進行提取，按“2.2”項下方法測定吸光度值，并計算其含量。由表2、3可知，影響玉女煎中多糖提取效果的因素大小順序為A>C>B，即提取次數(shù)>溶劑用量>提取時間，提取次數(shù)對試驗結果有極顯著性影響（P<0.01），溶劑用量對試驗結果有顯著性影響（P<0.05）。結合直觀分析，最佳提取方法為A3B1C3：即以12倍量的蒸餾水回流提取3次，每次30min。

2.5 驗證試驗 取玉女煎3份，每份約1g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，用確定的最佳提取條件進行提取，按“2.2”項下方法顯色測定吸光度值，并計算多糖的含量，多糖的含量分別為101.228、98.572和104.403mg/g（平均含量為101.068mg/g），RSD為3.38%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

苯酚-硫酸法是測定多糖含量的常用方法之一[24]，其原理為多糖在濃硫酸作用下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糠醛衍生物而與苯酚縮合生成有色化合物，該有色物具有紫外吸收且生成量與多糖濃度存在定量關系，故可用分光光度法在適當波長處測定吸光度，進而計算得到多糖含量。影響苯酚-硫酸法顯色的因素較多[25]，前期采用單因素考察的方法對苯酚-硫酸法中顯色的影響因素：6%苯酚用量（0.5、1、1.5ml）、硫酸用量（4、5、6ml）、顯色溫度（50、70、90、100℃）、顯色時間（30、40、50min）進行了考察，結果表明6%苯酚1ml、硫酸5ml、溫度90℃、水解時間40min顯色最佳。

研究通過正交實驗設計對玉女煎多糖提取工藝進行了優(yōu)化，根據(jù)直觀分析和方差分析可知，提取次數(shù)和提取溶劑用量對玉女煎多糖提取效果的影響最大，提取時間對多糖提取效果影響較小，從而確定玉女煎多糖最佳的提取工藝條件是12倍量的蒸餾水回流提取3次，每次30min。該工藝穩(wěn)定可行，可用于玉女煎多糖的提取。

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（收稿日期：2015.08.10）