狗蟻草不同萃取部分含藥血清對HSC—T6細胞增殖的影響

吳霜　曹思思　鄭作文

【摘 要】 目的：探究狗蟻草不同萃取物對肝星狀細胞（HSC-T6）增殖的影響。方法：制備狗蟻草不同溶劑萃取物的含藥血清，通過MTT法檢測含藥血清對肝纖維化體外模型HSC-T6增殖的影響。結果：狗蟻草乙酸乙酯萃取物10%、5%、2.5%含藥血清、95%乙醇提取物10%含藥血清對HSC-T6細胞增殖有抑制作用。結論：狗蟻草乙酸乙酯萃取物和95%乙醇提取物能夠抑制HSC-T6細胞的增殖，其中狗蟻草乙酸乙酯萃取物活性優于95%乙醇提取物。

【關鍵詞】 狗蟻草；肝纖維化；肝星狀細胞

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）22-0023-02

狗蟻草為豆科鏈莢豆屬植物狗蟻草Alysicarpus vagnalis（Linn.） DC.的全草，又名練莢豆、假花生、山土豆、大葉青等，主要分布于廣西、廣東、海南、云南等地[1]。狗蟻草性涼，味甘、苦，具有去腐生肌、活血通絡、清熱化濕的功效，臨床用于治療筋骨酸痛、慢性肝炎、跌打損傷等[2]。狗蟻草為廣西的道地藥材，民間用其來治療慢性肝炎，但迄今為止，狗蟻草抗肝纖維化作用的研究在國內外未見有報道。實驗通過肝纖維化體外HSC-T6細胞模型來研究狗蟻草不同溶劑萃取物的抗肝纖維化活性。

1 儀器與材料

1.1 藥材 狗蟻草由廣西中醫藥大學藥用植物教研室韋松基教授鑒定為豆科植物鏈莢豆Alysicarpus vagnalis（Linn.） DC.的全草。

1.2 實驗動物 昆明種小鼠（清潔級）48只，雌雄各半，體重（20±2）g，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：桂醫動字第11004號。

1.3 細胞株 HSC-T6細胞購買于上海博蘊有限公司。

1.4 材料 石油醚（分析純，批號：20130820，成都市科龍化工試劑廠）；氯仿（分析純，批號：20130518，成都市科龍化工試劑廠）；正丁醇（分析純，批號：20130409，成都市科龍化工試劑廠）；乙酸乙酯（分析純，批號：201305040，成都市科龍化工試劑廠）；DMSO（批號：020120709370，Amresco）；青鏈霉素混合液（批號：1491907，Gibco）；胎牛血清（批號：121005，浙江天杭生物科技有限公司）；MTT（批號：410c051，Solarbio）；秋水仙堿（批號：C8190，北京索萊寶科技有限公司）。

1.5 儀器 Epoch酶標儀（美國BIO-TEK公司）；311型CO2培養箱（美國ThermoForma公司）；TB-215型丹佛精密天平（德國賽多利斯公司）；HVE-50型自動高壓滅菌器（日本HIRAYAMA公司）；DLE560型超凈工作臺（荷蘭Clean Air公司）；明澈-D 24 UV超純水儀（法國默克密理博公司）；G3型旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備 取狗蟻草干燥藥材，剪碎，稱重，置于開口反應器中加適量95%乙醇浸泡過夜，次日加入藥材12倍量的95%乙醇，回流提取3次。依次保持微沸狀態2、1.5、1h，過濾，合并3次濾液，減壓濃縮，干燥，得95%乙醇部位提取物。將95%乙醇提取后的藥材曬干，加入12倍量純水，按上述95%乙醇的提取步驟進行提取，得到水提物。取適量95%乙醇提取物，加水溶解，依次用用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮提取液，干燥，得狗蟻草石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。取昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機分為空白對照組、秋水仙堿組、95%乙醇提取物組、石油醚萃取物組、氯仿萃取物組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組、水提取物組，每組雌雄各3只。陽性對照組給秋水仙堿0.8mg/kg，空白對照組給純水，其余各組給予相應藥物，灌胃給藥，給藥劑量均相當于生藥量112 g/kg，灌胃容積均為20ml/kg，連續5d，每天2次。最后一次給藥（灌胃前禁食不禁水12h）1h后，摘眼球取血，3000rpm離心10min，取上清，于56℃下溫育30 min滅活，過濾除菌。每組藥物含藥血清設10%、5%、2.5%三個濃度，5%和2.5%含藥血清組再分別加入5%和7.5%空白對照小鼠血清，使各組培養液總血清含量均為10%[3]。

2.2 對HSC-T6細胞增殖的影響 取處于對數生長期的HSC-T6細胞，消化制成單細胞混懸液，取適量混懸液，用0.4%Trypan Blue染色，在顯微鏡下計數，活細胞百分數應大于90%。調整細胞濃度至5×103個/ml，取細胞懸液接種于96孔板中，100μl/孔，37℃、5% CO2的培養箱中培養，24h后吸出96孔板中的原培養液，加入相應含藥血清培養液200μl，每組藥物的含藥血清分別設4個復孔，37℃、5% CO2的培養箱中培養，24h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）15μl，37℃培養4h，吸去上清液，每孔加DMSO 150μl，室溫下用微量振蕩器震蕩10min，酶標儀雙波長法測吸光度A570/630（檢測波長570nm，參照波長630nm），根據抑制率=（對照組A570/630 - 給藥組孔A570/630）/對照組A570×100%計算抑制率。

2.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件，計數資料以均數加減標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

由表1可知，狗蟻草不同萃取物含藥血清作用于HSC-T6細胞24h后，其乙酸乙酯萃取物含藥血清在10%、5%、2.5%三個濃度下，HSC-T6細胞增殖明顯低于空白對照組（P<0.05）；狗蟻草95%乙醇提取物含藥血清在10%濃度下，HSC-T6細胞增殖明顯低于空白對照組（P<0.05）；HSC-T6細胞在狗蟻草石油醚、氯仿、正丁醇、水提取物含藥血清培養液中的增殖與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

4 討論

肝纖維化是指由各種致病因素引起的肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀，是細胞外基質的合成持續大于細胞外基質降解的結果，是各種慢性肝臟疾病發展的必經階段[4]。肝纖維化的發生涉及肝星狀細胞（HSC-T6）、肝細胞、Kupffer細胞、竇內皮細胞等多種細胞以及多種細胞因子和酶，其中肝星狀細胞的激活是肝纖維化的關鍵環節[5]。當肝臟細胞受到損傷時，機體就會分泌血小板源性生長因子、轉化生長因子β、肝細胞生長因子等激活靜息狀態的肝星狀細胞，激活的肝星狀細胞大量增殖，并轉化為肌成纖維細胞合成大量的細胞外基質[6]，導致細胞外基質合成增加降解減少。鑒于肝星狀細胞在肝纖維化發展中的重要作用，研究以肝星狀細胞為靶細胞，建立肝纖維化體外模型用于抗肝纖維化藥物的篩選有重要意義[7]。中藥化學成分復雜，如果直接加入到細胞培養體系中，化學成分的理化性質可能干擾實驗結果導致假陽性的產生。另外，中藥的化學成分未必是發揮療效的成分，有些藥物需經過機體代謝后才產生具有療效的物質。所以直接將中藥或成分復雜的提取物加入到培養體系中研究其藥效是不大合適的，而含藥血清藥理學方法是將藥物作用于動物后，取動物血清作為藥物加入到培養體系中，可以很好避免上述弊端[8-9]。MTT法可以檢測細胞活力和數目，靈敏度高，重復性好，簡單易操作，快速、經濟而且無放射污染，廣泛用于細胞增殖實驗[10]。故實驗采用MTT法檢測狗蟻草不同溶劑萃取物的含藥血清對HSC-T6細胞增殖的作用，結果顯示，狗蟻草乙酸乙酯提取物10%、5%、2.5%含藥血清、95%乙醇提取物10%含藥血清對HSC-T6的增殖有抑制作用，表明狗蟻草乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物可能具有抗肝纖維化活性，且狗蟻草乙酸乙酯提取物抗肝纖維化活性可能優于95%乙醇提取物。

參考文獻

[1] 李蘭興，彭家崇，異葉鏈莢豆引種觀察及利用研究[J].中國草原與牧草，1985，2（1）：40-42.

[2] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草[M ].上海：上海科學技術出版社，1999：326.

[3] 王勤，王巍，龍穎，等.羅漢果甜苷對肝星狀細胞 HSC-T6增殖及肝纖維化相關基因的影響[J].中草藥，2013，44（3）：331.

[4] 張斌.肝纖維化的發病機理研究進展[J].現代診斷與治療，2004，15（6）：354.

[5] 葉國榮.肝星狀細胞在肝纖維化中的作用[J].現代消化及介入診療，2007，12（10）：90.

[6] 張哲，郭津生.肝星狀細胞的起源與功能[J].中華臨床醫師雜志，2010，4（4）：459-462.

[7] 劉嘩，齊荔紅，王碩豐，等.肝星狀細胞HSC-T6體外肝纖維化模型的建立[J].藥學實踐雜志，2005，23（6）：339-342.

[8] 崔曉蘭，賀玉琢，高英杰，等.中藥藥理研究的新思路-中藥學清藥理學[J].中國中醫藥科技，1997，4（4）：239.

[9] 田代真一.血清藥理學和血清藥化學[J].現代東洋醫學，1992，13 （1）：113-117.

[10] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival[J].Immuno Methods， 1983，65（1）：55-63.

（收稿日期：2015.08.07）