雌激素受體β通過非激素配體途徑減輕β淀粉樣蛋白對PC12細胞的毒性作用

李　娜，蔣志宏，代　玥，馬　強

(大連大學附屬中山醫院 神經內科，遼寧 大連116001)

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雌激素受體β通過非激素配體途徑減輕β淀粉樣蛋白對PC12細胞的毒性作用

李娜，蔣志宏，代玥，馬強*

(大連大學附屬中山醫院 神經內科，遼寧 大連116001)

摘要：目的研究在無雌激素作用下雌激素受體β過表達對PC12細胞在β淀粉樣蛋白刺激下抗炎、抗凋亡能力的影響。方法取普通PC12細胞為對照組，Ad-EGFP空白質粒轉染的PC12細胞為空白組，Ad-ERβ-EGFP轉染的PC12細胞為轉染組，western blot法檢測3組中ERβ蛋白的表達。隨機選取未感染的PC12細胞為對照組，轉染ERβ后的PC12細胞分為過表達組和ABI-2組，3組均加入培養液及Aβ，ABI-2組還加入Akt特異性抑制物ABI-2。實時定量PCR法測定3組在β淀粉樣蛋白刺激作用下炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA的表達；流式細胞術測定3組在β淀粉樣蛋白刺激作用下的凋亡情況。結果ERβ在轉染后PC12細胞內高表達。過表達組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達明顯低于對照組及ABI-2組。過表達組PC12細胞凋亡率明顯低于對照組及ABI-2組。結論ERβ在不依賴雌激素受體的情況下，通過Akt途徑發揮其抗炎、抗凋亡及減輕Aβ細胞毒性的作用。

關鍵詞：雌激素；雌激素受體；阿爾茨海默病；β淀粉樣蛋白；PPAR-γ

(ChinJLabDiagn,2016,20:0198)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)發病機制尚未完全清楚，臨床缺乏有效的藥物治療。與男性相比，女性在80-85歲后AD的發病率明顯增加，因此認為雌激素在AD的發生、發展中起到了重要的作用[1]。研究表明，雌激素可通過與神經細胞膜表面或核雌激素受體(estrogen receptor,ER)結合，發揮抗炎、抗氧化、抗凋亡能力，并拮抗β淀粉樣蛋白的毒性作用，從而延緩AD的病程[2]。但雌激素替代性治療可大大絕經后女性增加患乳腺癌及子宮內膜癌的風險，因而限制了其用于治療AD的臨床價值。

ER主要包括α和β兩種亞型，除了經典的雌激素-雌激素受體途徑，ERβ在無雌激素結合情況下以不依賴配體的形式激活胞內通路，進而發揮生物學作用[3]。因此，在不應用有潛在致癌風險的雌激素的情況下，是否可以通過單純調控ERβ表達發揮其對AD的神經保護作用呢？本研究利用腺病毒(adenovirus,Ad)為載體，將ERβ基因導入PC12細胞并使其在PC12細胞中過表達。并以普通PC12細胞為對照，研究在無雌激素作用下ERβ過表達對PC12細胞在β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)刺激下抗炎、抗凋亡能力的影響。

1材料與方法

1.1主要實驗器材與試劑

腺病毒基因載體Ad-ERβ-EGFP由吉凱基因化學技術有限公司(上海)代為構建。BSA、TBST購自博士徳公司(武漢，中國)。ERβ一抗IgG和二抗IGM均購自santa cruz公司。Superscript III Reverse Transcriptase試劑盒購自Invitrogen公司。PCR試劑盒購自北京Transgene生物技術有限公司。TNF-α和IL-1β mRNA特異性引物由上海生物工程研究所合成。AnnexinV-FITC、PropidiumIodide購自南京凱基生物科技發展有限公司。Calibur流式細胞儀購自BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1Ad-ERβ-EGFP轉染PC12細胞將PC12細胞制成單細胞懸液，加入24孔板(2×105/孔)中。以5×107，1×108，5×108，1×1094個不同滴度將Ad-ERβ-EGFP病毒加入孔中，然后將細胞放入37℃，含5 % CO2的細胞培養箱內孵育48 h，在不同時間點于熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光表達情況。利用同樣方法構建Ad-EGFP空白質粒轉染PC12細胞。通過顯微鏡下觀察挑選綠色熒光表達最強的細胞，消化后進一步擴增培養。

1.2.2Western blot檢測PC12細胞中ERβ的表達取普通PC12細胞為對照(Control)組，Ad-EGFP空白質粒轉染的PC12細胞為Vector組，Ad-ERβ-EGFP轉染的PC12細胞為ERβ組，檢測3組中ERβ蛋白的表達，其具體過程如下：RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采取BCA法測定總蛋白濃度。總蛋白行10% SDS-PAGE不連續凝膠電泳，濕法電轉膜，BSA封閉2 h，TBST洗脫后加一抗 1∶1 000于4度孵育過夜，TBST洗脫，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后行ECL化學發光法顯示結果。

1.2.3構建AD細胞模型并分組隨機選取未感染的PC12細胞為 Model組，加入培養液以及Aβ至終濃度為20 μM。隨機選取轉染ERβ后的PC12細胞分為Aβ組和ABI-2組，ERβ組中加入培養液及Aβ至終濃度為20 μM；ABI-2組中除培養液和Aβ外，還加入Akt特異性抑制物ABI-2至終濃度20 μM。將3組細胞放入37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h后待測。

1.2.4實時定量PCR取3組細胞懸液離心(5 min，800 g)后徹底棄上清，按照說明書方法通過Trizol提取總RNA，使用Superscript III Reverse Transcriptase試劑盒進行cDNA合成。將2.5 μl合成的cDNA、1 μl特異性引物與TransStartTM SYBR Green qPCR Supermix充分混合后，在ABI 7500 PCR儀上進行實時定量PCR測定，以GAPDH mRNA內參，定量產物濃度。

1.2.5檢測PC12細胞凋亡取3組PC12細胞，通過PI和Annexin V-FITC測定凋亡率，具體步驟如下：將待測細胞制成單細胞懸液，每個樣品加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻后避光4攝氏度下孵育30 min，再加入5 μl PropidiumIodide(PI)，充分混勻，室溫下避光反應15 min，使用BD流式細胞儀進行測定，Annexin V表達陽性的細胞為凋亡細胞。

1.3統計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行數據處理。計量資料均用平均值±標準差表示，分組資料以相對數表示。組間比較采用方差分析及q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1Ad-ERβ-GFAP可有效轉染PC12細胞

由左至右分別為病毒滴度為5×107，1×108，5×108，1×109時轉染的PC12細胞。

圖1Ad-ERβ-GFAP質粒轉染PC12細胞

PC12細胞經腺病毒轉染24 h后即出現熒光表達，48 h后表達最強，病毒濃度梯度不同，表達效果不一樣。PC12細胞熒光表達量隨病毒濃度增高而增加，病毒濃度為5×108/孔時熒光表達達到頂峰，病毒濃度為1×109/孔時熒光表達量并無明顯增加，因此選取5×108/孔時感染的PC12行進一步實驗 (如圖1)。

2.2ERβ在轉染后PC12細胞內高表達

Western blot結果顯示：ERβ蛋白在各組PC12細胞內均有表達，其中轉染組ERβ蛋白含量明顯高于對照組與空白組(P<0.01)；與對照組及空白組相比， ERβ蛋白表達無明顯差異(P>0.05)，見圖2。表明ERβ基因可成功導入PC12細胞中并過表達，空白Ad質粒對PC12細胞ERβ表達無影響。

圖2PC12細胞中ERβ的表達 可見轉染組ERβ表達顯著高于對照組和空白組(*P<0.01 vs 空白組，**P<0.01 vs 對照組)；空白組和對照組ERβ表達無明顯差異。

2.3過表達ERβ減輕Aβ對PC12細胞的致炎作用

實時定量PCR結果發現：過表達組TNF-α mRNA表達明顯低于對照組(P<0.01)，低于ABI-2組(P<0.05)；過表達組IL-1β mRNA含量低于對照組(P<0.05)，低于ABI-2組(P<0.05)，具體數值見表1。

表1　PC12細胞中TNF-α mRNA和IL-1 mRNA表達量

可見轉染組PC12細胞中TNF-α mRNA表達明顯低于對照組(*P<0.01)，低于ABI-2組(**P<0.01)；轉染組PC12細胞中IL-1 mRNA表達低于對照組和ABI-2組(*P<0.05，**P<0.05)

2.4過表達ERβ減輕Aβ對PC12細胞的凋亡作用

經Annexin V/PI標記法流式細胞術對對照組、過表達組和ABI-2組3組PC12細胞檢測發現，過表達組PC12細胞凋亡率為 (11.27±2.14)%，明顯低于對照組(21.14±4.13)%(P<0.01)，低于ABI-2組(15.33±4.21)%(P<0.05)，見圖3。

由左向右分別代表對照組、過表達組和ABI-2組中凋亡細胞百分比，結果可見過表達組PC12細胞凋亡率明顯低于對照組，低于ABI-2組。

3討論

腺病毒載體可以轉染不同類型的真核細胞，不受靶細胞是否為分裂細胞的限制，且轉基因效率高，體外實驗轉染效率通常接近100%，容易制得高滴度病毒載體。另外，Ad進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，安全性高[4]。本實驗發現，ERβ在普通PC12細胞中表達量極低，ERβ基因可被有效轉導入PC12細胞并在細胞中過表達。且通過與對比普通PC12細胞相比發現，空白Ad載體轉染PC12對細胞中ERβ的表達并無影響，可以用于進一步實驗。

AD的病理特征為神經元數量減少、細胞內神經原纖維纏結和細胞外β樣淀粉蛋白沉積，因此認為β樣淀粉蛋白是誘導AD的發生、發展的重要致病物質[5,6]。Aβ可刺激小膠質細胞釋放炎癥因子，誘發氧化應激，損害膽堿能神經以及誘導凋亡。本研究利用實時定量PCR檢測發現，在加入Aβ后，PC12細胞中重要炎癥因子TNF-α和IL-1β表達量明顯增加，且通過流式細胞儀發現PC12細胞的凋亡率也明顯增加，驗證了Aβ對細胞的毒性作用。通過與普通PC12細胞的對比，轉染ERβ的PC12細胞在無雌激素的環境下，細胞內炎癥因子的表達明顯減少，且凋亡率也有所下降，說明ERβ可以通過非結合雌激素的方式減輕Aβ對細胞的毒性以及抗凋亡作用。

Akt又被稱為蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是一種分子量約為 60 kDa的絲/蘇氨酸蛋白激酶，處于多條信號通路的重要交叉點，具有調節細胞生長、分化及凋亡的關鍵作用[7]。通過對AD患者額葉及顳葉標本檢測發現，Akt的活性和磷酸化濃度明顯降低，并有研究發現激活Akt途徑能在體外減輕Aβ對細胞的毒性作用[8]。另外，當雌激素受體與配體結合后，可通過Akt途徑發揮生物學作用[9]，但尚無ERβ是否可以以非配體依賴方式與Akt途徑相互作用的報道。本研究在無雌激素存在的情況下，向轉染ERβ的PC12細胞中加入Akt的特異性抑制物API-2后發現，ERβ的抗炎、抗凋亡能力受到抑制。結果充分說明了ERβ在不依賴雌激素受體的情況下，是通過Akt途徑發揮其抗炎、抗凋亡及減輕Aβ細胞毒性的作用。是否還有別的途徑參與ERβ的非配體依賴，還需要進一步研究。

參考文獻：

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Estrogen receptor β attenuates the toxicity in PC12 cells induced by β-amyloid via estrogen independent pathwayLINa,JIANGZhi-hong,DAIYue,etal.(TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of estrogen receptor beta on beta amyloid induced inflammation and apoptosis in PC12 cells without estrogen stimulus.MethodsPC12 cells were divided into control group,blank group,and Ad-ERβ-EGFP group,treatment with PBS,blank vector and Ad-ERβ-EGFP,respectively.Western blot was used to detect ER beta protein expression in three groups.Uninfected PC12 cells were randomly selected as control group.After transfection of ERβ,PC12 cells were divided into Over-expression group and ABI-2 group.All 3 groups were treated with Aβ,whereas ABI-2 group was also added with Akt specific inhibitor ABI-2.Real time quantitative PCR was used to detect TNF-α and IL-1β mRNA expression.Flow cytometry was used to apoptosis.ResultsERβ over-expressed in PC12 cells after transfection.TNF-α and IL-1β mRNA expression in over-expression group were significantly lower than those of the control group and ABI-2 groups.Apoptosis of PC12 cells in over-expression group was obviously lower than those of the control group and ABI-2 group.ConclusionInependent of estrogen,ERβ could represent anti-inflammatory and anti apoptotic effects and thus reduce the toxic effects of Aβ via Akt pathway.

Key words:estrogen;Estrogen receptor;Alzheimer's disease;Amyloid beta;PPAR-gamma

(收稿日期：2015-03-12)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R741.02；Q816

文章編號：1007-4287(2016)02-0198-04

*通訊作者