TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR快速檢測光滑念珠菌

郭　毅,楊靖嫻,邵冬華,劉　靜,梁國威

(北京大學航天臨床醫(yī)學院 檢驗科，北京100049)

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TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR快速檢測光滑念珠菌

郭毅,楊靖嫻,邵冬華,劉靜,梁國威*

(北京大學航天臨床醫(yī)學院 檢驗科，北京100049)

摘要：目的采用TaqMan-MGB探針作為檢測信號，建立快速檢測光滑念珠菌的實時熒光定量PCR方法。方法以光滑念珠菌核糖體RNA編碼基因(rDNA)中的內轉錄間隔區(qū)2(ITS2)作為靶基因，設計特異性引物和TaqMan-MGB探針。在梯度光滑念珠菌純菌液標本中評價所建方法靈敏度和重復性；在102株光滑念珠菌臨床分離株、非光滑念珠菌的其他4種念珠菌臨床分離株、7種細菌臨床分離株和人基因組的DNA中評價所建方法特異度；并在模擬光滑念珠菌血癥的血標本中初步探討其臨床應用價值。結果所建方法對光滑念珠菌純菌液的檢測下限為101CFU/ml，相應的批內、批間變異系數(shù)(CV)分別為1.68%和2.84%。對102株光滑念珠菌臨床分離株檢出率為100%；對非光滑念珠菌無交叉反應，顯示該方法特異性為100%。對模擬光滑念珠菌血癥血標本的最低檢測下限為101CFU/ml。結論所建方法具有特異性和靈敏度高、重復性好的特性，適于臨床上光滑念珠菌血癥的快速檢測。

關鍵詞：光滑念珠菌；熒光定量PCR；內轉錄間隔區(qū)2(ITS 2) ；TaqMan-MGB探針；血流感染

(ChinJLabDiagn,2016,20:0178)

目前念珠菌中光滑念珠菌的臨床分離率僅次于白色念珠菌，可達到19%-26.7%[1，2]。由于光滑念珠菌對唑類抗真菌劑廣泛耐藥[3,4]，而且對棘白菌素和多烯類藥物不敏感的菌株也呈逐漸增多趨勢[5]，所以早期確診由光滑念珠菌引起血流感染對臨床診療具有重要的指導意義。

文獻顯示，多數(shù)PCR方法側重于針對念珠菌屬或者白色念珠菌菌種的檢測[6]，但對于光滑念珠菌的檢測方法則較為少見，而采用TaqMan-MGB探針作為實時熒光定量PCR檢測信號檢測光滑念珠菌的方法未見報道。

因此，本研究的目的是以光滑念珠菌核糖體RNA編碼基因(rDNA)中的內轉錄間隔區(qū)2(ITS2)作為靶基因，設計特異性引物和TaqMan-MGB探針，建立光滑念珠菌的實時熒光定量PCR檢測方法，并對該方法的應用價值進行初步評價。

1材料與方法

1.1實驗材料(1)標準菌株：光滑念珠菌 (ATCC 2001)1株，購自中國普通微生物菌種保藏中心；(2)臨床分離菌株：來自航天中心醫(yī)院微生物室菌種保存庫，包括102株光滑念珠菌、135株白色念珠菌、61株熱帶念珠菌、24株近平滑念珠菌、12株克柔念珠菌、24株大腸埃希菌、24株肺炎克雷伯菌、24株變形桿菌、24株粘質沙雷菌、24株銅綠假單胞菌、24株鮑曼不動桿菌以及24株金黃色葡萄球菌。以上菌株經(jīng)微生物鑒定儀(VitekⅡ，生物梅里埃公司，法國)鑒定確認；(3)血液標本10例，來自健康志愿者。

1.2臨床分離菌株及人基因組DNA提取(1)菌株DNA提?。翰捎脽嵝菘朔ㄌ崛【闐NA。具體步驟：菌懸液100℃加熱15 min，-80℃冷凍10 min，重復3次，12 000 r/min 離心15 min，上清即為菌株DNA粗提液，-80℃保存?zhèn)溆谩?2)人基因組DNA提?。喊凑昭夯蚪MDNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)操作步驟，從健康志愿者血液標本中提取人基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3光滑念珠菌梯度菌液配制和DNA提取(1)光滑念珠菌計數(shù)：采用改良牛鮑式血球計數(shù)板，按標準操作規(guī)程計數(shù)。(2)梯度菌液配制和提?。簩⒐饣钪榫?ATCC2001)計數(shù)后的107CFU/ml的菌液進行10倍梯度稀釋，取稀釋后的菌液各100 μl，分別注入900 μl DNA提取液Ⅰ中(中山大學達安基因股份有限公司.中國)。按上述熱休克法提取DNA后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4光滑念珠菌梯度模擬感染血標本的配制及其DNA提取(1)將光滑念珠菌(ATCC2001)計數(shù)后的107CFU/ml的菌液進行10倍梯度稀釋，取稀釋后的菌液各100 μl，分別注入900 μl EDTA抗凝的健康人血液中，制成梯度模擬感染血標本。(2)DNA提?。荷鲜鰳吮局屑尤?00 μl細胞裂解液CL(天根生化科技有限公司，中國)，室溫10 min，12 000 r/min 離心15 min后棄上清；之后向沉淀加入1 ml Polaris細胞裂解液[7](500 mM Na2CO3和1% SDS)，室溫5 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清。400 μl DNA提取液Ⅰ重懸沉淀后，按熱休克法提取DNA，上清液經(jīng)過濾柱，50 μl 洗脫，-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物和探針設計在Pubmed的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中檢索ATCC 2001光滑念珠菌ITS2序列(GenBank:JQ070075.1)，通過比對篩選種內變異率小和種間特異性高的序列，使用Primer 5.0軟件設計特異性引物和TaqMan-MGB探針。上游引物：5’- GCC ATA TCA GTA TGT GGG ACA CG-3’、下游引物5’-GTA TTA ACC CCC GCC GCT-3’，TaqMan-MGB探針：5’-VIC-CAA ACG AGC AGC AGA TTA AT-NFQMGB-3’，擴增片段長度為80 bp。

1.6實時熒光定量PCR反應體系與擴增條件PCR反應體系為20 μl，包括模板DNA 2 μl，上下游引物各2 μl(0.5 μmol/L)(北京賽百盛基因技術有限公司，中國)，TaqMan-MGB探針1 μl(0.25 μmol/L)(ABI公司，美國)，2.5×Master Mix 8 μl和20×Probe Enhancer solution 1 μl(天根生化科技有限公司，中國)，水1 μl。循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s 和60 ℃ 1 min，進行45個循環(huán)。循環(huán)閾值(Ct值)設定在0.03，基線設定為自動設定，測定儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

2結果

2.1所建方法檢測靈敏度評價以梯度為106-101 CFU/ml的光滑念珠菌菌液提取的DNA為模板，對各水平DNA同時進行10次PCR反應，顯示皆有特異性擴增曲線，其中101 CFU/ml 菌液所對應的Ct值為34.89±0.59。顯示本方法最低可從101 CFU/ml的菌液中檢出光滑念珠菌，見圖1。濃度為106-101 CFU/ml純菌液標本的PCR擴增標準曲線的斜率=-3.163，R2=0.990。

圖1光滑念珠菌標準菌株純菌液梯度PCR擴增曲線圖中6-1代表濃度為106-101 CFU/ml光滑念珠菌純菌液；NC代表陰性對照。

2.2所建方法檢測重復性評價對106-101CFU/ml 的光滑念珠菌各梯度菌液的DNA分別進行10次批內和批間的重復性檢測。批內CV值的變化范圍為0.21%-1.68%，其中101CFU/ml對應的V值最大(1.68%)。批間CV值的變化范圍為1.15%-2.84%，101CFU/ml濃度對應的CV值最大(2.84%)，詳見表1。

表1　所建方法檢測各梯度菌液DNA的批內、批間Ct值

2.3檢測方法特異度評價采用所建方法檢測不同來源DNA(具體目錄見本文“材料與方法 1.實驗材料”部分)，以評價其特異性。其中102株光滑念珠菌臨床分離菌株全部檢出(檢出率為100%)。其它非光滑念珠菌來源的DNA檢測結果均為陰性，顯示該方法對于檢測光滑念珠菌的特異度為100%。

2.4梯度念珠菌模擬感染血標本檢測情況對含菌量為106-101CFU/ml的光滑念珠菌模擬感染血標本DNA進行檢測(平行重復3次)，結果顯示對于血流感染標本的檢測下限為101CFU/ml(Ct值為37.87±1.05)，見圖2。含菌量106-101CFU/ml模擬感染血標本的PCR標準曲線的斜率=-3.26，R2=0.998。

圖2光滑念珠菌標準菌株模擬感染血標本擴增曲線圖中6-1代表含菌量為106-101CFU/ml光滑念珠菌模擬感染血標本，NC代表陰性對照。

3討論

本研究選擇光滑念珠菌rDNA基因中ITS2區(qū)作為擴增靶序列，設計特異性引物和TaqMan-MGB探針，成功建立了實時熒光定量PCR檢測光滑念珠菌的方法。該方法對于光滑念珠菌純菌液的檢出下限為101CFU/ml，相應批內和批間變異率分別為1.68%和2.84%。特異性評價顯示，102株光滑念珠菌臨床分離株檢出率為100%，且與研究所納入的其它念珠菌、細菌以及人基因組DNA標本無交叉反應。另外，通過對模擬感染血標本的檢測，證實該方法對于血流感染中光滑念珠菌的檢測下限也可達到101CFU/ml。

ITS2序列位于真核生物5.8S和28S rDNA之間，在種間高度特異[8]，可作為設計種特異性引物和探針的位點。本研究以光滑念珠菌 ATCC 2001菌株的ITS2序列作為比對標準序列。首先，在Pubmed數(shù)據(jù)庫進行種間序列比對(nucleotide blast)，顯示光滑念珠菌ITS2序列與人基因組、細菌庫、真菌庫、病毒庫、衣原體庫、支原體庫、立克次氏體庫皆無顯著重疊序列，特別是對于同光滑念珠菌表型、生化反應等特性相似的C.nivariensis和C.bracarensis也能作出很好的區(qū)分。實際檢測結果也顯示本方法對光滑念珠菌以外的各種生物來源DNA皆無顯著性擴增曲線。其次，進行光滑念珠菌種內ITS2序列比對，篩選種內變異少的序列區(qū)間作為引物和探針的靶序列。通過對數(shù)據(jù)庫中的116條光滑念珠菌ITS2參考序列的比對，顯示本研究設計的引物和探針序列中均無種內變異，據(jù)此計算的光滑念珠菌理論檢出率為100%。我們采用所建方法對102株光滑念珠菌臨床分離株進行了檢測，檢出率為100%，未出現(xiàn)漏檢的情況。

TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針3′端增加MGB (Minor Groove Binder，小溝結合物)修飾的一種水解探針，其特性包括：(1)顯著提高探針與模板結合的Tm值，15個堿基的探針可以提高 Tm 達18℃，允許設計更短的探針；(2)探針3′端-1 ～ -7位堿基內的單一堿基錯配可抑制探針與模板的結合，顯著提高探針特異性；(3)熒光本底低，提高信噪比[9]。利用上述特性，本研究設計的TaqMan-MGB探針長度為20 bp，除了避開了光滑念珠菌ITS2序列種內堿基變異外，還同時增加了光滑念珠菌種間區(qū)分能力，提高了檢測特異度。在光滑念珠菌純菌液中，本方法的檢測下限可達到101CFU/ml，優(yōu)于Foongladda 等在18S rDNA上設計引物和采用普通水解探針的檢測結果(525 CFU/ml)[10]。而且濃度為101CFU/ml光滑念珠菌純菌液的批內、批間的CV值分別為1.68%和2.84%，重復性良好，可滿足常規(guī)臨床要求(CV值<5%)。

血液中的血細胞成分是否完全去除可顯著影響PCR檢測的靈敏度。如有報道稱血紅素會造成DNA聚合酶的解離，從而影響PCR反應的進行[11]；而白細胞的殘留也會使得大量人基因組DNA釋放到樣本中，干擾引物和探針與模板，特別是與低濃度模板的配對。本實驗借鑒Loonen AJ[7]等人所采用的細胞裂解方法，結合實驗結果等具體情況，改良出一套適合本實驗室的紅細胞和白細胞去除流程，詳見“實驗方法”中的(4)。實驗顯示，我們對光滑念珠菌模擬感染的DNA檢測的靈敏度可達到101CFU/ml，優(yōu)于Lehmann LE[12]等人采用高分辨溶解曲線原理所建立檢測方法(含菌量為102CFU/ml時，檢出率為100%；含菌量為30 CFU/ml時，檢出率為75%)，也優(yōu)于Roche公司SeptiFast試劑盒對于血流中光滑念珠菌的檢測下限(102CFU/ml)[13]。另外，與Loffler 等[14]所述紅、白細胞裂解法相比，還具有耗時短、成本低、試劑配制簡易等優(yōu)點。

綜上所述，本研究所述的基于光滑念珠菌ITS2序列，采用TaqMan-MGB探針作為檢測信號的熒光定量PCR方法，具有檢測靈敏度和特異性高，重復性好以及檢測時間短等優(yōu)點，顯著優(yōu)于臨床常規(guī)的血培養(yǎng)方法，適于臨床光滑念珠引起的血流感染的快速鑒定。

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Rapid detection ofCandidaglabrataby using a TaqMan-MGB probe-based quantitative real-time PCR assayGUOYi,YANGJing-xian,SHAODong-hua,etal.(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityAerospaceSchoolofClinicalMedicine，Beijing100049,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a TaqMan-MGB probe-based quantitative real-time PCR assay for rapid identification ofCandidaglabrata(C.glabrata).MethodsThe internal transcribed spacer 2 (ITS2) on ribosomal DNA (rDNA) ofC.glabratawas used as a target for designing specific primers and TaqMan-MGB probe.The sensitivity and reproducibility of the present method were evaluated with serial diluted samples ofC.glabrata.The specificity of the method was validated in DNA samples from clinical isolates of 102 strains ofC.glabrata,4 other species of non-glabrataCandida,7 species of bacteria and human blood specimen,respectively.We also evaluated the clinical application values of the assay using simulatedC.glabratacandidemia in blood samples.ResultsThe lowest counts ofC.glabratathat the assay can measure accurately was 101CFU/ml,and its coefficients of variability (CV) of intra-assay and inter-assay were 1.68% and 2.84%,respectively.The detectable rate was 100% for 102 clinical isolates ofC.glabrata.No cross reaction by the assay were observed indicating the specificity was 100%.For simulated infection blood samples,the detection limit ofC.glabratawas 101CFU/ml by the assay.ConclusionThe newly developed method was a highly sensitive and specific assay,which could be applied to rapid diagnosis of bloodstream infections induced byC.glabrata.

Key words:Candidaglabrata;Real-time PCR;Internal Transcribed Spacer 2(ITS2);TaqMan-MGB probe;Bloodstream infections

(收稿日期：2015-11-10)

文獻標識碼：A

中圖分類號：Q78

文章編號：1007-4287(2016)02-0178-04

*通訊作者

基金項目：北京大學航天臨床醫(yī)學院科研基金(YN201322)