強直性脊柱炎患者血小板參數和外周血B、T淋巴細胞衰減因子及調節性T細胞變化

劉磊，劉健，萬磊

(1.湖北中醫藥大學，武漢 430065; 2.安徽中醫學院第一附屬醫院風濕科)

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·論著·

強直性脊柱炎患者血小板參數和外周血B、T淋巴細胞衰減因子及調節性T細胞變化

劉磊1，劉健2，萬磊2

(1.湖北中醫藥大學，武漢 430065; 2.安徽中醫學院第一附屬醫院風濕科)

[摘要]目的觀察強直性脊柱炎(AS)患者血小板參數的變化及外周血B、T淋巴細胞衰減因子(BTLA)、調節性T細胞(Treg)的表達。方法選取60例AS患者，檢測患者血小板參數，采用流式細胞術檢測外周血BTLA及Treg的表達，觀察AS患者血小板變化及其影響因素。結果AS患者存在血小板參數異常變化，表現為PLT、PCT的升高。與正常組比較，AS患者外周血BTLA及Treg的表達降低；與BTLA正常者比較，BTLA異常組血小板參數PLT、PCT升高；與Treg正常者比較，Treg異常者血小板參數PLT、PCT升高，MPV降低(P<0.05 or P<0.01)。血小板參數與BTLA、Treg及C3、hs-CRP、IGG存在一定相關性(P<0.05 or P<0.01)。結論AS患者外周血BTLA、Treg表達降低可能是引起血小板參數異常的原因。

[關鍵詞]脊柱炎,強直性；血小板功能試驗；T淋巴細胞,調節性 ; 血沉

血小板不僅參與凝血與止血過程，血小板及其活化產物如血小板顆粒、腫瘤壞死因子、生長因子等多種活性分子均參與了機體的炎性反應過程，并與眾多免疫性疾病的病情密切相關[1]。強直性脊柱炎(AS)是一種慢性、進行性、自身免疫性炎性疾病，該病以骶髂關節及中軸關節炎性病變為主要臨床特征，并伴有血液系統、心臟、肺部、神經系統等關節外病變損害[2-4]。該病的發病機制目前尚未明確。研究表明，B、T淋巴細胞衰減因子(BTLA)及調節性T細胞(Treg)參與了類風濕關節炎等多種自身免疫性疾病的發病過程[5-7]。本研究觀察了60例AS患者血小板參數、BTLA及Treg的變化，以探討血小板在AS病變中的意義及作用機制。

1對象與方法

1.1研究對象從2011年7月至2012年10月安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕免疫科住院患者中選取60例AS患者，其中男41例，女19例，男：女約為2∶1；年齡18～60歲，平均年齡(35.0±10.7)歲；病程0.5～30年，平均病程(7.17±6.30)年。另設20例為健康對照組(NC組),男12例，女8例，男：女為3：2；平均年齡為(41.9±11.7)歲，均來自安徽中醫學院第一附屬醫院體檢中心，經體檢和免疫學檢查排除自身免疫性疾病，均為身體健康、無明顯器質性疾病者。設計、實施、評估者：全部為作者，均受過正規培訓，未采用盲法評估。本研究方案經醫院倫理委員會批準，且經患者知情同意。

1.2診斷標準參照1987年美國風濕病學會(ARA)修訂的AS診斷標準[8]。

1.3納入標準①符合上述診斷標準；年齡在18～60歲之間；③自愿參加本研究,并簽署知情同意書。

1.4排除標準有下列以下情景者，不納入本次研究：①患者合并有影響血小板數量的疾病，或嚴重心、肝、腎等重要臟器疾病和血液、內分泌疾病者；②不符合年齡標準者；③妊娠期及哺乳期女性；④精神行為異常者。

1.5檢測方法

1.5.1BTLA的檢測取AS患者全血100 μL，加入BTLA 10 μL。置樣品于室溫避光染色30 min。加入溶血素3 mL，室溫避光10 min，離心5 min，棄上清。加入2 mL PBS洗滌2次，以含1%多聚甲醛的PBS重懸，使用FACSAria 流式細胞儀檢測分析BTLA占淋巴細胞(LC) 百分比。藻紅蛋白(PE) 標記的BTLA試劑盒購于美國貝克曼公司。

1.5.2Treg的檢測分別采集RA患者外周靜脈血2 mL，肝素抗凝；取肝素抗凝的全血100 μL，加入小鼠抗人CD4-FITC 10 μL、CD25-PE 5 μL、CD127-PE-Cy5 10 μL，室溫閉光反應30 min；加2 mL溶血劑在室溫下溶解紅細胞，室溫閉光約10 min；PBS洗滌2次，離心5 min(1500 r/min)，棄上清。

1.5.3血小板參數的檢測用日本SysmexXT-2000i全自動血細胞分析儀檢測血小板參數：血小板計數(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板分布寬度(PDW) 、血小板平均體積(MPV)，測定方法采用酶聯免疫吸附法。

1.5.4實驗室指標的檢測紅細胞沉降率(ESR)采用魏氏法檢測；C反應蛋白(CRP)、IgG、IgA、IgM、C3、C4采用HITACHI 7060全自動生化儀檢測。

1.6統計學處理采用SPSS17.0統計學軟件分析數據,兩組間計數資料比較采用χ2檢驗；實驗數據為連續性變量采用正態性和方差齊性檢驗，兩組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Spearman分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1血小板參數變化在AS組中的異常率見表1。

表1　AS組與NC組血小板異常率比較[例(%)]

注：與NC組比較,aP<0.01，bP<0.05

2.2AS患者血小板參數與BTLA、Treg及其他實驗室指標的相關分析血小板參數PLT與CD3+BTLA+T cell、CD4+BTLA+T cell、Treg成負相關；PCT、PDW與CD8+BTLA+T cell成負相關；MPV與CD4+BTLA+T cell成正相關；PLT與C3、hs-CRP、IGG成正相關；PCT與IGG成正相關(P﹤0.05或P﹤0.01),見表2。

表2　AS患者血小板參數與實驗室指標的相關性分析

注：aP<0.05,bP<0.01

2.3AS患者外周血血小板、BTLA、Treg及實驗室指標變化與正常組比較，AS組患者血小板參數PLT、PCT顯著升高(P<0.05或P<0.01)；外周血CD3+BTLA+T cell、CD4+BTLA+T cell、CD8+BTLA+T cell、Treg的表達頻率顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見表3。

2.4AS患者外周血BTLA、Treg異常者血小板參數變化與BTLA正常者比較，BTLA異常組血小板參數PLT、PCT升高；與Treg正常者比較，Treg異常者血小板參數PLT、PCT升高，MPV降低(P﹤0.05或P﹤0.01)，見表4。

組別例數CD3+BTLA+Tcell(%)CD4+BTLA+Tcell(%)CD8+BTLA+Tcell(%)Treg(%)血小板參數PLT(×109/L)PCT(%)PDW(fL)MPV(fL)正常組2044.75±4.7479.28±6.3974.84±11.486.71±1.75154.30±34.6325.2±2.813.83±2.2611.34±1.01AS組6029.10±6.69a48.90±5.97a51.77±16.92a5.68±1.36a251.38±61.64a27.3±4.2b13.28±2.3710.83±1.11

注：aP<0.01,bP<0.05

組別例數BTLAPLT(×109/L)PCT(%)PDW(fL)MPV(fL)TregPLT(×109/L)PCT(%)PDW(fL)MPV(fL)正常組14163.87±51.3924.0±4.613.18±1.5010.61±1.10203.68±77.7226.1±5.112.86±1.5111.57±1.00異常組46268.31±33.41a29.2±3.7a12.98±1.5511.03±0.87248.63±52.86a28.9±3.8b13.14±1.5410.94±0.85b

注：與正常組比較，aP<0.01,bP<0.05

3討論

本研究表明AS組患者血小板參數PLT、PCT顯著升高。PLT是反映外周血小板生成及衰亡的動態指標，PCT反映了單位容積的全血中血小板體積所占比例，也是監測血小板較為靈活的指標，MPV代表平均血小板大小。PLT一般與PCT及MPV的變化一致[9]。而在同屬自身免疫性疾病的RA病變過程中，血小板參數PLT、PCT增高在一定程度上反映了關節滑膜侵蝕性炎癥的活動程度[10]。相關性分析表明，AS患者PLT與CD3+BTLA+T cell、CD4+BTLA+T cell、Treg成負相關；PCT、PDW與CD8+BTLA+T cell成負相關；MPV與CD4+BTLA+T cell成正相關；表明T淋巴細胞免疫功能失調可能參與了血小板參數的異常升高。PLT與C3、hs-CRP、IGG成正相關,PCT與IGG成正相關。說明調節性T細胞，BTLA，補體系統、免疫球蛋白系統可能共同參與并導致了AS患者血小板參數的異常升高。異常升高的血小板活化生成大量趨化因子與血小板活化因子，招募單核巨噬細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞等與血小板相互聚集、黏附[11]，使機體產生、維持炎性反應，進而引起中軸關節肌腱、韌帶及骨附著點纖維化與軟骨骨化，最終導致關節強直，功能受限。

本研究表明，與BTLA、Treg正常者比較，AS患者BTLA異常組PLT、PCT升高；Treg異常組，MPV降低。提示BTLA及Treg可能直接或間接參與了AS患者血小板參數的異常改變。BTLA是免疫球蛋白超家族中新近發現的抑制性分子，對T細胞活化、增殖具有負性調節作用[12-14],并在CD4+T細胞外周免疫耐受過程中起著很重要作用[15]。Treg負性調節T淋巴細胞的活化與增值，Treg可以通過直接接觸、釋放細致性細胞因子(IL-35)、顆粒酶殺傷CD4+、CD8+T 細胞、B細胞與單核細胞[16-17]。當BTLA及Treg表達降低，T細胞產生異常活化，部分T細胞產生大量多種致炎性細胞因子，造成滑膜及骨關節軟組織的不同程度損傷或破壞；而部分T細胞活化后激活B細胞，產生大量補體如C3、C4等和IgM、IgG、IgA等，異常表達的補體及免疫球蛋白直接或間接參與抗原結合形成免疫復合物，引發炎性反應從而加重了血液系統的損傷，進一步導致血小板參數異常升高。

綜上所說，強直性脊柱炎患者存在血小板參數的異常改變，表現為PLT、PCT的顯著升高。AS患者血小板參數變化的機制與BTLA及Treg密切相關。其機制可能是AS患者外周血BTLA及Treg低表達引發對T細胞的負性調節降低，異?；罨腡細胞可激活補體系統并釋放大量炎性因子，引發炎性因子失衡，進而引發血小板參數的異常改變。

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The changes of platelet parameters,BTLA and Treg in peripheral blood in patients with ankylosing spondylitisLiuLei*,LiuJian,WanLei(*HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the changes of platelet parameters,BTLA and Treg in peripheral blood in patients with ankylosing spondylitis.MethodsSixty patients with ankylosing spondylitis were slected.Biochemical analyzer was used to measured platelet parameters and other laboratory parameters,using flow cytometry to determinate BTLA and Treg expression in peripheral blood.The platelet parameters changes and the correlate with other parameters were observed.ResultPLT,PCT of ankylosing spondylitis patients were increased.Compared with normal control,BTLA and Treg expressing of AS patients were reduced significantly.Compared with BTLA normal group,PLT and PCT of AS patients were increased in BTLA abnormal group.Compared with Treg normal group,PLT and PCT of AS patients were increased and MPV reduced significantly in BTLA abnormal group(P<0.05 or P<0.01).The platelet parameters and BTLA,Treg were correlated with C3,hs-CRP,IGG(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe platelet parameters abmormalities maybe related to the imbalance of BTLA and Treg expression in patients with ankylosing spondylitis.

[Key words]Spondylitis,ankylosing；Platelet function tests；T-lymphocytes,regulatory;Blood sedimentation

(收稿日期：2015-02-09)

Corresponding author:Liu Jian,Email：liujianahzy@126.com

中圖分類號:R593.23

文獻標識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.003

作者簡介：劉磊，博士在讀，Email:dr_tcm_liu@126.com通信作者：劉健,博士，主任醫師，教授，博士生導師,Email：liujianahzy@126.com

基金項目:國家中醫藥重點學科中醫痹病學建設項目(國中醫藥發[2009]30號)；安徽省科技廳科研計劃項目(09020304046)；安徽省衛生廳中醫藥科研項目(2009ZY05)；安徽中醫學院科技創新團隊項目(2010TD005)。