肺癌的液體活檢和檢測技術進展

康艷麗 綜述,曹穎平 審校

(福建醫科大學附屬協和醫院檢驗科,福州 350000)

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·綜述·

肺癌的液體活檢和檢測技術進展

康艷麗 綜述,曹穎平△審校

(福建醫科大學附屬協和醫院檢驗科,福州 350000)

液體活檢；循環腫瘤細胞；循環腫瘤DNA；微小核糖核酸；外泌體

原發性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一。據統計，2013年我國主要癌癥發病順位和死因順位排第一的均是肺癌，肺癌年齡標化病死率高達40.41/10萬。肺癌具有發病率高、發病機制復雜、早期難以發現、治療效果不佳等特點。腫瘤標志物有助于早期診斷肺癌，對早發現、早治療有重要作用，并在精準醫療和個體化治療中起重要作用。根據《原發性肺癌診療規范(2015版)》，癌胚抗原、細胞角蛋白19片段抗原、神經元特異性烯醇化酶和胃泌素釋放前肽及鱗狀上皮細胞癌抗原已被推薦為常用的原發性肺癌標志物[1]。數據庫顯示，在初診時57%的肺癌患者已經發生了遠處轉移[2],所以發現新的用于早期診斷和個體化治療的腫瘤標志物十分必要。

小活檢組織標本肺癌病理診斷主要為明確有無腫瘤及腫瘤類型[3]。由于活檢具有創傷性，且多次活檢患者的依從性差，液體活檢成為當下熱門研究方向。液體活檢的優點包括以下幾項：無創傷，標本容易獲取，可以反映腫瘤的整體狀態，可以實現實時監測。液體活檢項目目前主要包括循環腫瘤細胞(CTCs)、循環腫瘤DNA(ctDNA)、微小核糖核酸(miRNA)和外泌體等。

1　CTCs

1.1CTCs作為潛在標志物的研究進展CTCs是由原發腫瘤細胞脫落到循環血液中形成，它具有原發性腫瘤的特征，是潛在的生物標志物[4]。CTCs可以作為療效評測指標。在一項研究中，非小細胞肺癌(NSCLC)放療前檢測了CTCs數量，隨著放療后腫瘤縮小，CTCs數量也減少，表明CTCs可以作為放療療效評測指標[5]。CTCs也可作為預后指標。有研究報道，Ⅴ期的CTCs數量高于Ⅲ期患者，且治療前較少CTCs的患者治療后的總生存期和無進展生存期更長，表明CTCs是潛在的預后指標[6]。CTCs作為活的腫瘤細胞實體，可提供突變和藥物敏感性分析變化。其細胞的完整性可進行細胞水平的研究，從DNA、RNA、表觀遺傳學等方面提供信息。

1.2CTCs的檢測技術進展CTCs在血液中含量少，大概每100萬血細胞(1 mL血液)中混雜1個腫瘤細胞。因此進行CTCs研究時必須先進行富集，可采用免疫親和、免疫磁珠標志、RT-PCR、CTC chip等方法。CTCs的檢測方法包括計數、免疫熒光、原位雜交、細胞培養、測序等方法。其中CTCs全基因組擴增和檢測方法包括基于PCR的qPCR、ARMs-PCR、ME-PCR、dPCR和基于二代測序的Thermo Fisher等方法。

1.3CTCs的臨床局限性CTCs同時具有局限性，其分離需要特殊設備，難以確定是否為真正的腫瘤細胞，因此依賴單細胞測序技術的發展。CTCs具有腫瘤異質性，樣本代表性不強。這些問題仍然影響其在臨床運用。

2　ctDNA

2.1ctDNA作為潛在標志物的研究進展人體的血液中存在血漿游離DNA(cfDNA),其中攜帶腫瘤特有突變信息的成為ctDNA。ctDNA來源于壞死的或者凋亡的腫瘤細胞[7]。研究表明，ctDNA可以用來重建腫瘤基因[8]。Qiu等[9]指出，ctDNA是表皮生長因子受體(EGFR)基因突變狀態檢測中具有高特異性和有效性的生物標志物，ctDNA的分析將是非小細胞肺癌的個性化癌癥治療的一個關鍵部分。Nie 等[10]指出，許多基因的改變，如基因突變、雜合性缺失、微衛星不穩定性和基因甲基化，均可在非小細胞肺癌患者ctDNA中發現。因此這些結果表明ctDNA可以作為一個可行的工具來監測NSCLC。研究表明，ctDNA檢測腫瘤變異比CTCs有更高的敏感性[11]。目前ctDNA被CFDA推薦用于晚期NSCLC中血漿EGFR的檢測。最近研究表明ctDNA涵蓋腫瘤整體突變信息，比局部組織活檢更具有惡性整體表現[12]。其攜帶某種腫瘤特異性突變或其他基因組改變信息，可用于早期篩查，表現為假陽性低，特異性好，可攜帶腫瘤細胞的體細胞突變。

2.2ctDNA的檢測技術進展ctDNA在腫瘤患者體內的含量很低，約占整體cfDNA的1%，半衰期短，約為2 h。因此需要靈敏度高的檢測技術。目前常用的有digital PCR、BEAMing、標記擴增深度測序和癌癥個體化深度測序等方法[13]。

2.3ctDNA的臨床局限性ctDNA數量少，且容易被正常的cfDNA掩蓋，因此需要進一步提高靈敏性。ctDNA檢測結果無法定位，無法檢測蛋白質，無法從細胞層面進行功能研究。而且，目前由于技術的局限，ctDNA尚無統一的標準，給臨床使用帶來一定的局限性。

3　miRNA

3.1miRNA作為潛在標志物的研究進展miRNA是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸[14]。成熟的miRNA形成RNA誘導的沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。不同的miRNA在不同肺癌類型中起不同的作用。有研究報道，在NSCLC中起到致癌作用的有miR-21、miR-17/92、miR-31、miR-224等，在NSCLC中起到抑癌作用的有let-7、miR-34b。miR-25在小細胞肺癌(SCLC)中起致癌作用，在SCLC中起抑癌作用的有miR-34、miR-138、miR-126。方楚玲等[15]綜述了miRNA對肺癌化療耐藥的調控，提出：miRNA與藥物轉運相關，如miR-495與順鉑藥物敏感性增加有關[16]；miRNA與細胞損傷后自我修復能力有關，如miR-138與ERCCL的mRNA結合導致順鉑敏感性增加[17]；miRNA調控細胞凋亡相關基因，如miR-135a與APC的mRNA結合，導致紫杉醇耐受[18]；miRNA與上皮細胞間質化有關，如miR-200家族。在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達模式具有分化的位相性和時序性，提示miRNA有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。

3.2miRNA的檢測技術進展和臨床局限性miRNA常用的檢測技術有RT-PCR、miRNA芯片、Sanger測序、熒光原位雜交、基因敲除和過表達等方法。miRNA種類繁多，相同的miRNA在不同的腫瘤中都可能有異常表達，缺乏腫瘤異質性和代表性，在臨床上使用上存在局限性。

4　外泌體

4.1外泌體作為潛在標志物的研究進展外泌體是細胞主動向胞外分泌的大小均一的囊泡樣小體,具有抗腫瘤免疫，促血管新生等生理功能[19]。不同類型的細胞可以釋放出外泌體。外泌體包含脂類、蛋白質、mRNA、miRNA等[20]。外泌體可以用來做早期診斷、預后判斷、耐藥評估。腫瘤來源的外泌體促進腫瘤細胞生長、轉移和耐藥[21]。Xiao等[22]認為抑制外泌體的形成和釋放可能是潛在的新的治療肺癌的策略。Rodriguez等[23]分析了外泌體中不同的miRNA。Frydrychowicz等[24]也認為認識外泌體和外泌體中的miRNA可能是認識肺癌的關鍵，為肺癌治療提供了新思路。外泌體能有效地保護核酸物質且穩定性好，克服ctDNA容易被降解的問題，可以用做ctDNA和miRNA的補充分析。

4.2外泌體的檢測技術進展和臨床局限性外泌體數量多于CTCs，更容易富集。常用檢測技術有免疫磁珠法、色譜法、動態光散射技術、納米微粒追蹤分析術等。目前，利用外泌體來研究NSCLC相對較少。其分離需要特殊設備，可分析的標志物相對較少，無法進行細胞層面的研究，有一定的臨床局限性。

5　小　　結

肺癌具有發病機制復制、早期難以發現等疾病特點，有效的、能夠用于早期發現的標志物的研究對肺癌治療十分必要。組織活檢是診斷肺癌的金標準，但具有創傷性和多次活檢的依從性較差的特點，而液體活檢無創且可以實時監測。本綜述側重描述當前熱門的CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體和其檢測技術的進展，同時分析了臨床局限性。為肺癌的精準醫療和個體化治療提供新的參考。液體活檢除了檢測CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體之外，還可以檢測mRNA、IncRNA等。在檢測技術的不斷創新中，靈敏度不斷的提高，特別是新一代測序、擴增阻滯突變系統、ddPCR、熒光條形碼標記分子檢測技術等新技術，液體活檢這種無創傷的檢測將會成為檢驗科新的趨勢，也為精準醫學和個體化醫學提供新的研究參考。

[1]支修益，石遠凱，于金明．中國原發性肺癌診療規范(2015年版)[J]．中華腫瘤雜志，2015，37(1)：67-78．

[2]Edwards BK,Anne-Michelle MS,Mariotto AB,et al.Annual Report to the Nation on the status of cancer,1975-2010,featuring prevalence of comorbidity and impact on survival among persons with lung,colorectal,breast,or prostate cancer[J].Cancer,2014,120(9):1290-1314.

[3]石遠凱 孫燕，余金明,等.中國晚期原發性肺癌診治專家共識(2016年版)[J].中國肺癌腫瘤雜志,2016,9(1):1-15.

[4]O′Flaherty JD,Gray S,Richard D,et al.Circulating tumour cells,their role in metastasis and their clinical utility in lung cancer[J].Lung Cancer,2012,76(1):19-25.

[5]Dorsey JF,Kao GD,Macarthur KM,et al.Tracking viable circulating tumor cells(CTCs) in the peripheral blood of non-small cell lung cancer(NSCLC) patients undergoing definitive radiation therapy:pilot study results[J].Cancer,2015,121(1):139-149.

[6]Krebs MG,Sloane R,Priest L,et al.Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2011,29(12):1556-1563.

[7]Schwarzenbach H,Hoon DS,Pantel K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients[J].Nat Rev Cancer,2011,11(6):426-437.

[8]Thierry AR,Mouliere F,El Messaoudi S,et al.Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA[J].Nat Med,2014,20(4):430-435.

[9]Qiu M,Wang J,Xu Y,et al.Circulating tumor DNA is effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung cancer:a meta-analysis[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2015,24(1):206-212.

[10]Nie K,Jia Y,Zhang X,et al.Cell-free circulating tumor DNA in plasma/serum of non-small cellluncancer[J].Tumour Biol,2015,36(1):7-19.

[11]Punnoose EA,Atwal S,Liu W,et al.Evaluation of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer:association with clinical endpoints in a phase II clinical trial of pertuzumab and erlotinib[J].Clin Cancer Res,2012,18(8):2391-2401.

[12]Kuo YB,Chen JS,Fan CW,et al.Comparison of KRAS mutation analysis of primary tumors and matched circulating cell-free DNA in plasmas of patients with colorectal cancer[J].Clin Chim Acta,2014,433(7):284-289.

[13]Newman AM,Bratman SV,To J,et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J].Nat Med,2014,20(5):548-554.

[14]Croce CM.Oncogenes and cancer[J].N Engl J Med,2008,358(5):502-511.

[15]方楚玲,郭琳瑯.miRNA對肺癌化療耐藥調控研究進展[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(1):72-76.

[16]Guo L,Liu Y,Bai Y,et al.Gene expression profiling of drug-resistant small cell lung cancer cells by combining microRNA and cDNA expression analysis[J].Eur J Cancer,2010,46(9):1692-1702.

[17] Wang Q,Zhong M.Alterations of microRNA in cisplatin-resisitant human non-small cell lung cancer cells(A549/DDP)[J].Exp lung Res,2011,37(7):427-434．

[18]Holleman A,Chung I,Olsen RR,et al.miR-135a contributes to paclitaxel resistance in tumor cells both in vitro and in vivo[J].Oncogene,2011,30(43):4386-4398.

[19]Lotvall J,Valadi H.Cell to cell signalling via exosomes through esRNA[J].Cell Adh Migr,2009,1(3):156-158.

[20]Mathivanan S,Fahner CJ,Reid GE,et al.ExoCarta 2012:database of exosomal proteins,RNA and lipids[J].Nucleic Acids Res,2012,40(1):1241-1244.

[21]Grange C,Tapparo M,Collino F,et al.Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche[J].Cancer Res,2011,71(15):5346-5356.

[22]Xiao X,Yu S,Li S,et al.Exosomes:decreased sensitivity of lungcancer A549 cells to cisplatin[J].PLoS One,2014,9(2):e89534.

[23]Rodriguez M,Silva J,Lopez-Alfonso A,et al.Different exosome cargo fromplasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer[J].Genes Chromosom Cancer,2014,53(9):713-724.

[24]Frydrychowicz M,Kolecka-Bednarczyk A,Madejczyk M,et al.Exosomes-structure,biogenesis and biological role in non-small-cell lung cancer[J].Scand J Immunol,2015,81(1):2-10.

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2016-03-03

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