某院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLVA基因分型及流行狀況研究*

陳　揚，胡大春，崔　穎，王　林，劉德華，邵劍春，穆士杰△

(1.第四軍醫大學唐都醫院輸血科，陜西西安 710038；2.昆明市第一人民醫院檢驗科，云南昆明 650011)

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·論著·

某院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLVA基因分型及流行狀況研究*

陳揚1，胡大春2，崔穎1，王林1，劉德華2，邵劍春2，穆士杰1△

(1.第四軍醫大學唐都醫院輸血科，陜西西安 710038；2.昆明市第一人民醫院檢驗科，云南昆明 650011)

摘要:目的通過構建適合臨床實驗室常規應用的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株同源性多位點可變數目串聯重復序列分析(MLVA)分型方法，建立昆明地區臨床分離MRSA菌株的MLVA基因分型基礎數據庫，分析醫院MRSA感染流行情況。方法收集昆明市第一人民醫院臨床微生物室2010年10月至2013年12月分離的111株MRSA菌株，對7個可變數目串聯重復序列(VNTR)位點進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和產物電泳分析，歸類各菌株的基因型別。結果VNTR09-01位點測序結果顯示9 bp的重復子，重復規律性不強、易突變；111株分離株被分為25個基因型別(A～Y)，其中G、A、B為主要型別，分別占47.7%、13.5%、8.1%；呼吸內科、神經外科、重癥監護室(ICU)和乳腺科存在MRSA集中流行趨勢。結論MLVA分型方法可推廣應用于本研究中7個VNTR位點多態性檢測，部分科室存在MRSA同源菌集中流行情況，值得高度關注。

關鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；基因分型；多位點可變數目串聯重復序列分型

1961年，英國學者Jevons首次發現耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[1]。2011年美國感染病學會(IDSA)MRSA感染治療指南——《IDSA-2011-MRSA指南》中報道，美國醫院細菌感染中MRSA感染率為31.8%，遠超其他細菌感染率[2]，其所致感染呈散發、流行，甚至暴發[3-4]。我國金黃色葡萄球菌臨床分離株中MRSA所占百分比增至50%以上[5]，根據2011年中國CHINET細菌耐藥性監測數據[6]，MRSA僅對噁唑烷酮類、利奈唑胺、萬古霉素等糖肽類抗菌藥物敏感。MRSA引起醫院感染的暴發已成為重點關注的公共衛生問題之一。本研究構建適合臨床實驗室常規應用的MRSA菌株同源性多位點可變數目串聯重復序列分析(MLVA)分型方法，建立本地臨床分離MRSA菌株的MLVA基因分型基礎數據庫，分析MRSA的醫院流行情況，為制訂有效控制措施提供客觀依據。

1材料與方法

1.1菌株來源收集昆明市第一人民醫院檢驗科微生物室2010年10月至2013年12月臨床分離鑒定的MRSA菌株111株。

1.2儀器與試劑MicroScan WalkAway 40 SI全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(德國西門子公司)；聚合酶鏈式反應(PCR)試劑、50 bp DNA標記物(美國Fermentas公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest公司)。

1.3MRSA臨床菌株的分離培養與鑒定參照《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)的臨床病原微生物分離培養方法進行菌株的分離培養，根據血漿凝固酶試驗，金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)單克隆抗體檢測和MicroScan WalkAway 40 SI全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行菌種鑒定和抗菌藥物敏感性試驗。

1.4MRSA菌株DNA提取采用離心柱法提取高濃度的模板DNA。

1.5可變數目串聯重復序列(VNTR)位點多態性檢測方法的建立

1.5.1引物設計與合成本研究參考Schouls等[7]在S.aureus strain N315基因組序列中尋找的VNTR序列位點，采用BLASTN進行引物序列比對和特異性驗證后，從中選取7個分辨力和分型能力較好的位點，由上海生工公司合成其側翼特異性引物，見表1(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

1.5.2反應體系和條件上、下游引物各1.5 μL，Taq緩沖液5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)4 μL，氯化鎂(MgCl2)4 μL，DNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶1.4 μL，雙蒸水補至50 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(各自引物的Tm值-5 ℃)，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃后延伸10 min。

1.5.3結果檢測與分析配制2%的瓊脂糖凝膠，用50 bp DNA標記物確定其相對分子質量。用50 bp DNA標記物作為相對分子質量對照，按照產物片段大小確定其多態性情況，即人工估算出各細菌株各VNTR序列位點的基序重復次數。

1.6所構建的PCR方法對菌株VNTR多態性檢測的驗證

1.6.1重復性驗證從研究菌株中抽取24株，每株MRSA用7對引物進行不同位點VNTR多態性擴增檢測3次，分析3次產物的一致性。

1.6.2正確性測序驗證選取14株研究菌株(編號為1～14號)，分別對所構建的7個VNTR位點多態性PCR檢測方法進行測序驗證。

1.7臨床分離MRSA菌株的MLVA分型數據庫建立對7個VNTR位點及其核心基序重復次數進行編號，然后分別對111株臨床分離MRSA菌株中每一株細菌進行7個VNTR位點多態性組合編碼，并根據其編碼進行MLVA型別歸類，得出MLVA分型數據庫數據。

1.8臨床分離主要MLVA型別菌株的流行趨勢分析根據MLVA分型結果及菌株分離的時間，分析主要MLVA型別菌株的流行時間分布及病房分布情況。

2結果

2.1PCR方法對菌株VNTR多態性檢測的重復性驗證從研究的MRSA菌株中抽取24株，每株MRSA在不同VNTR位點重復檢測3次，每次DNA擴增片段大小完全相符。

2.2PCR方法對菌株VNTR多態性檢測的正確性測序驗證選取14株研究菌株(編號為1～14號)，分別對所構建的7個VNTR位點多態性PCR檢測方法進行測序驗證，VNTR09-01位點的9 bp重復子規律性不強，堿基突變率較高。VNTR位點序號2上游引物擴增產物測序結果見圖1、2(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)，其中重復子基序為60 bp，3、4號研究菌株分別重復0次(見圖1)和7次(見圖2)。其余各VNTR位點引物擴增產物測序序列圖略。

2.3111株臨床分離MRSA菌株6個VNTR位點的多態性檢測部分菌株(24株)中6個VNTR基因位點的多態性檢測結果，見圖3(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。各位點的VNTR多態性變化，見表2。

2.4111株臨床分離MRSA的MLVA基因分型依據6個VNTR序列位點多態性在111株臨床分離MRSA菌株中的變化信息，對各株細菌進行基因VNTR多態性編碼，具有相同編碼的菌株歸類為同一分型類別中，得到111株臨床分離MRSA菌株的MLVA基因型別歸類數據庫。111株分離株可分為25個基因型別(A～Y)，其中G、A、B為主要型別，分別占47.7%(53/111)、13.5%(15/111)、8.1%(9/111)。

2.5主要MLVA型別菌株的流行趨勢分析根據MLVA分型結果及菌株分離的時間進行分析，主要MLVA型別菌株的流行時間分布情況見圖4(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)；病房分布情況見圖5(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)，呼吸內科、神經外科、重癥監護室(ICU)和乳腺科存在MRSA集中流行趨勢。

3討論

目前，脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)作為細菌分子分型的“金標準”而被首推[8]，但其操作繁瑣、費時。2009年，Schouls等[7]對529株金黃色葡萄球菌分別采用MLVA、Spa和PFGE 3種分型方法進行比較，結果顯示MLVA與PFGE有相似多樣性指數。2010年陶曉霞等[9]參考Sabat選取的5個VNTR位點對49株MRSA進行了MLVA分型，結果顯示該方法與PFGE具有較好的符合率。此外，在Pourcel等[10]收集的300株MRSA研究中，顯示MLVA與多位點序列分型(MLST)和Spa分型方法相比有較強的分辨力，且另有研究證明VNTR的重復性和穩定性更好[11]。在本研究選取的7個VNTR位點中，6個位點的分辨力和分型能力較好，操作較PFGE更為簡單易行、快速，在臨床實驗室具有較好的可操作性，值得推廣應用。

本研究在對2010年10月至2013年12月收集到的111株分離自住院患者臨床標本的MRSA進行MLVA型別歸類后，發現呼吸科、神經外科、ICU和乳腺科在以上時間段內存在MRSA集中流行趨勢。醫務人員的手是引起醫院MRSA感染的重要傳播途徑之一，由醫務人員的手傳播細菌而造成的醫院感染占30%左右[9]。因此，應進一步提高醫務人員手衛生依從性，努力阻斷MRSA的傳播途徑。

綜上所述，MLVA可推廣應用于本研究中7個VNTR位點多態性檢測，該院部分科室存在MRSA同源菌集中流行情況，值得高度關注。

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MLVA genotyping and the prevalence status analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from a hospital*

ChenYang1，HuDachun2，CuiYing1，WangLin1，LiuDehua2，ShaoJianchun2，MuShijie1△

(1.DepartmentofBloodTransfusion,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China；2.DeparmentofClinicalLaboratory,theFirstPeople′sHospitalofKunmingCity,Kunming,Yunnan650011,China)

Abstract:ObjectiveTo establish multiple-locus variable-number tandem repeat assay(MLVA) genotyping database for clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) in Kunming area and analyse the prevalence status of MRSA in hospital,through establishing a classification method for MRSA by homology MLVA which was appropriate to routine application in clinical laboratory.MethodsA total of 111 strains of MRSA isolated by the Clinical Microbiology Chamber of the First People′s Hospital of Kunming City from October 2010 to December 2013 were collected.The polymerase chain reaction(PCR) amplification and electrophoresis for analysis of PCR products were carried out for the seven sites of variable number tandem repeats(VNTR),classification of strain based on genotypes was carried out,as well.ResultsThe sequencing results of VNTR09-01 site showed 9 bp repetitive sequence elements whose regularity was not strong,and the repetitive elements was mutable.The 111 isolates were divided into 25 kinds of genotypes(A-Y),among which genotype G,A and B were the main types,accounted for 47.7%,13.5% and 8.1% respectively.ConclusionMLVA could be generally applied in the seven sites of VNTR in this study.Some departments might exit concentrated epidemic of homologous MRSA strains,which is worthy of being paid more attention.

Key words:methicillin-resistant Staphylococcus aureus；genotype；multiple-locus variable-number tandem repeat assay

基金項目：云南省教育廳科學研究基金項目(2010C097)。

作者簡介：陳揚，女，住院醫師，主要從事臨床微生物學與檢驗研究。 △通訊作者，E-mail:musj1963@fmmu.edu.cn。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.004

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0586-03

(收稿日期：2015-11-26)