耐甲氧西林金黃色葡萄球菌青霉素結合蛋白2a轉肽酶區的克隆、表達及純化鑒定*

馬洪玉，蘭小鵬，陳　敏

(南京軍區福州總醫院檢驗科,福建福州 350025)

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·論著·

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌青霉素結合蛋白2a轉肽酶區的克隆、表達及純化鑒定*

馬洪玉，蘭小鵬，陳敏△

(南京軍區福州總醫院檢驗科,福建福州 350025)

摘要:目的構建編碼耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)青霉素結合蛋白2a (PBP2a)轉肽酶區基因片段的原核表達載體，并表達、純化及鑒定蛋白。方法從臨床標本中分離鑒定MRSA，設計針對編碼PBP2a轉肽酶區基因片段的引物，采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的基因片段，克隆至pET28a(+)載體，雙酶切鑒定并測序，轉化大腸桿菌BL21(DE3)plysS株；用0.7 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達后，利用Ni親和層析技術純化目的蛋白；蛋白免疫印跡法(WB)鑒定重組蛋白。結果重組表達載體經BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，產物在預期大小處出現條帶，測序結果顯示有兩個堿基突變，無移碼突變。所表達的PBP2a蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和WB鑒定，在相對分子質量38×103處可見一新生蛋白條帶。結論成功構建了PBP2a轉肽酶區原核表達載體，并獲得了高效表達，制備了高純度的目的蛋白。

關鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；mecA基因；青霉素結合蛋白2a；轉肽酶區

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是醫院感染的重要病原菌之一，該菌對多種β-內酰胺類抗菌藥物具有內在耐藥性，給臨床治療帶來嚴重困難[1-2]。主要耐藥機制為MRSA獲得mecA基因，編碼青霉素結合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a與β-內酰胺類抗菌藥物親和力很低，因而使得MRSA對大多數抗菌藥物耐藥[3]。PBP2a由N-末端跨膜區、非青霉素結合區和轉肽酶區3部分組成。本研究采用從臨床分離鑒定的MRSA菌株，應用基因重組技術將編碼PBP2a轉肽酶區的DNA片段克隆至大腸桿菌表達載體，實現了其在大腸桿菌中的高效表達，并對重組蛋白進行了純化和鑒定，為后續相關研究打下基礎。

1材料與方法

1.1菌株來源MRSA臨床分離株、質粒pET28a(+)均由本室保存；大腸桿菌DH5α及BL21(DE3)plysS株購自全式金生物技術有限公司。

1.2材料與方法聚合酶鏈式反應(PCR)所用試劑Taq MIX、限制性核酸內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA連接酶均購自日本Takara公司；PCR純化、質粒提取及膠回收試劑盒購自上海生物工程股份有限公司；Ni親和層析預裝柱購自美國Novagen公司；PCR擴增儀購自杭州博日科技有限公司；凝膠成像儀購自珠海黑馬醫學儀器有限公司；兔抗PBP2a抗體購自Rio Ray公司。

1.3方法

1.3.1PCR擴增目的基因片段根據已公布的mecA基因序列，由Invitrogen(上海)公司合成一對寡核苷酸引物，上游引物：5′-CGG GAT CCA CTA TTG ATG CTA AAG TTC A-3′；下游引物：5′-GGA ATT CGC AAC CCA CGT TAC CGG ATT G-3′[4]。用接種針挑取本院檢驗科微生物實驗室保留的MRSA菌落，加入雙蒸水18 μL，Taq MIX 20 μL，上下游引物各1 μL，混勻，94 ℃預變性10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s，35個循環，72 ℃延伸5 min。

1.3.2重組表達載體的構建PCR所獲得的目的基因片段經1%瓊酯糖凝膠電泳，按膠回收試劑盒說明書回收純化后用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，并與同樣酶切的pET28a(+)載體T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態菌。通過酶切鑒定篩選出陽性重組子，并將陽性重組子送至Invitrogen(上海)公司進行序列測定。

1.3.3重組蛋白的表達將重組質粒轉化表達菌株BL21(DE3)plysS，然后挑取單個菌落，接種至含卡那霉素抗性的LB培養基中，37 ℃ 220 r/min振蕩培養過夜后，以1∶100轉接于新鮮的含卡那霉素的LB培養基中，37 ℃培養至吸光度值(A值)為0.6，取1 mL作為對照，其余加100 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.7 mmoL/L，繼續誘導培養5 h，取1 mL培養液離心收集細菌，重懸于50 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加等體積2×上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，取10 μL進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.3.4重組蛋白的復性將1 mL過夜培養的菌液轉接種于100 mL含卡那霉素的LB培養基中，按上述方法誘導目的蛋白的產生；4 ℃離心收集沉淀物，將沉淀用40 mL的緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，10 mmol/L乙二胺四乙酸，1% Triton X-100)重懸，冰浴中超聲破碎，10 000 r/min離心10 min收集沉淀；以40 mL的緩沖液A洗滌包涵體兩次，離心去上清，稱量包涵體凈重；加入40 mL緩沖液B[50 mmol/L 3-環己基氨基-1-丙磺酸，pH11.0，3% N-十二烷基肌胺酸鈉和1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)]輕輕混勻，室溫孵育15 min，10 000 r/min離心10 min至溶液澄清。將含有可溶蛋白的上清轉入透析袋中，每次透析所用緩沖液體積為2 000 mL緩沖液C(0.02 mol Tris-HCl，pH8.5，0.1 mmol/L DTT)4 ℃透析3 h，透析兩次，以緩沖液D (即不加DTT的緩沖液C)繼續透析兩次，以加入終濃度分別為1.0、0.2 mmol/L的還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽緩沖液D，4 ℃透析過夜；4 ℃ 1 000 r/min離心10 min去除沉淀，0.45 μm濾器過濾。

1.3.5重組蛋白的純化預裝柱經結合緩沖液(0.5 mol NaCl，5 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)平衡后，4 ℃條件下，將透析后的液體上樣，控制流速為10 mL/h，依次用10 mL結合緩沖液、10 mL漂洗緩沖液(0.5 mol NaCl，60 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)、5 mL洗脫緩沖液(0.5 mol NaCl，1 mol imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9)洗柱，分別收集洗脫液。分別取10 μL洗脫液加入等量2×SDS上樣緩沖液，混勻，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳。

1.3.6蛋白免疫印跡法(WB)鑒定重組蛋白取5 μL純化蛋白液，加等體積2×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，以未誘導菌的提取液做對照，經轉膜、封閉、結合稀釋1 000倍兔抗PBP2a一抗、稀釋2 000倍的羊抗兔二抗體后，發光鑒定，標定標記物，進行掃描。

2結果

2.1PCR擴增目的基因片段擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，約1 000 bp附近可見清晰的擴增條帶，與目的片段預期大小一致。見圖1。

M：DNA分子量標記物。

圖1PCR擴增目的基因片段

2.2重組表達載體的酶切鑒定和測序重組表達載體經BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，產物在預期大小(1 026 bp)處出現條帶，見圖2。測序結果與基因文庫登錄的目的片段序列(GenBank：X52593)僅有兩個堿基位點不一致，無移碼突變，核酸同源性為99.8%。見圖2。

M：DNA分子量標記物；1、2：非目的克隆酶切產物；3：目的克隆酶切產物。

圖2BamHⅠ/EcoRⅠ酶切重組表達載體

2.3重組蛋白的表達與純化重組質粒轉化菌經IPTG誘導后，在相對分子質量約38×103處新增明顯條帶，與理論相對分子質量一致。0.7 mmoL/L IPTG誘導的蛋白條帶最深。見圖3(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.4重組蛋白的鑒定經過WB純化的重組蛋白在38×103附近有明顯的陽性條帶，而對照菌的提取液則為陰性。見圖4(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

3討論

自20世紀60年代報道MRSA以來，MRSA所致的醫院感染率逐年上升，成為全球關注的嚴重醫院和社區感染病原菌[5-6]。MRSA是多重耐藥菌，耐藥性的遺傳決定子為mec，長約(30～50)×103，位于細菌染色體上，由mecA、mecI、mecRI及(20～40)×103的mec相關DNA 組成。mecA為結構基因，編碼產生PBP2a蛋白。PBP2a含有668個氨基酸，相對分子質量為78×103，該蛋白由N-末端跨膜區、非青霉素結合區和轉肽酶區3部分組成，其中轉肽酶區內含β-內酰胺類抗菌藥物作用位點[7-8]，在細菌耐藥中起主要作用。

目前，MRSA感染的診斷和治療策略主要以PBP2a為靶標[9-10]，PBP2a蛋白的表達是前提。本研究應用PCR技術擴增PBP2a轉肽酶區基因片段1 026×103，測序結果與基因文庫登錄的目的片段序列僅有兩個堿基位點不一致，無移碼突變，核酸同源性為99.8%。在重組蛋白的表達中筆者做了大量的試驗，使用不同表達載體，包括谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)表達載體的PGEX-4T、HIS表達載體的pet-22b、pet-28a。在不同的IPTG誘導濃度(0.4、0.7、1.0 mmoL/L)，不同的誘導時間(2、4、6、8、12 h)，不同的溫度(16、20、25、30、37 ℃)下檢測，均為包涵體表達的蛋白，證實在濃度0.7 mmoL/L的IPTG 37 ℃誘導6 h，蛋白的表達量最大，誘導其在大腸桿菌中高效表達。隨后應用Ni親和層析對重組蛋白進行了純化，筆者優化了溶解包涵體，結合、漂洗和洗脫條件，得到了高純度蛋白。

本實驗所表達的PBP2a蛋白經SDS-PAGE電泳和WB鑒定，在相對分子質量38×103處均可見一新生蛋白條帶，與MRSA-PBP2a轉肽酶區的相對分子質量相吻合，說明已成功誘導了PBP2a轉肽酶區蛋白，對PBP2a的分子生物學特性做了進一步探索，為MRSA感染的臨床診斷和防治方法的研究提供了理論基礎，將極大地推進MRSA感染難題的攻克。

參考文獻

[1]張連芝，王欣，周密，等．醫院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染現狀的分析[J]．中國實驗診斷學，2010，14(6)：1365-1366．

[2]李篤軍，蘇維奇，朱元祺．膠東地區耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性的研究[J]．中國實驗診斷學，2012，16(2)：290-292．

[3]Monecke S，Coombs G，Shore AC，et al．A field guide to pandemic,epidemic and sporadic clones of methicillin-resistant Staphylococcus[J]．PLoS One，2011，6(4)：e17936．

[4]徐霞，謝閨娥，杜晶春．耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a轉肽酶區的克隆表達及純化鑒定[J]．生物技術通訊，2006，17(4)：543-545．

[5]潘宏升，田素飛，年華，等．耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子流行病學研究[J]．微生物學雜志，2011，31(1)：34-38．

[6]Stefanis S，Chung DR，Lindsay JA，et al．Meticillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA):global epidemiology and harmonization of typing methods[J]．Int J Antimicrob Agents，2012，39(4)：273-282．

[7]Olarte NM，Valderrama IA，Reyes KR，et al．Methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization in a Colombian hospital intensive care unit:phenotypic and molecular characterization[J]．Biomedica，2010，30(3)：353．

[8]Yamada K，Yanagihara K，Hara Y，et al．Clinical features of bacteremia caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a tertiary hospital[J]．Tohoku J Exp Med，2011，224(1)：61．

[9]Fitzgerald-Hughes D，Devocelle M，Humphreys H．Beyond conventional antibiotics for the future treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections:two novel alternatives[J]．FEMS Immunol Med Microbiol，2012，65(3)：399-412．

[10]于一云，王紅，張淑文，等．復方清熱顆粒劑對MRSA PBP2a表達影響的實驗研究[J].中國中醫急癥，2009，18(9)：1483-1486．

Cloning,prokaryotic expression,purification and identification of the transpeptidase domain of penicillin binding protein 2a of methicillin-resistant Staphylococcus aureus*

MaHongyu，LanXiaopeng，ChenMin△

(DepartmentofClinicalLaboratory,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Fuzhou,Fujian350025,China)

Abstract:ObjectiveTo construct the prokaryontic expression vector of the gene fragment which encodes the transpeptidase domain of penicillin binding protein 2a(PBP2a) of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),and to express,purify and identify the objective protein.MethodsStrains of MRSA were isolated and identified from clinical samples,according to the sequence of mecA gene recorded in GenBank,the primers of mecA fragment which encoded the transpeptidase domain of PBP2a was designed.The gene fragment from MRSA was amplified by using polymerase chain reaction(PCR) and cloned into pET28a(+) plasmid.After being identified by enzyme digestion and sequencing,the recombinant plasmid was transformed into the strain of Escherichia coli BL21(DE3)plysS.The expression of transpeptidase domain of PBP2a was induced by 0.7 mmol/L IPTG,the expressed products were purified by using Ni afinity chromatography,then were analyzed by using Western blot.ResultsThe recombinant expression vector was digested by BamHⅠ and EcoRⅠ,and the products were at the expected size.The result of sequencing showed two bases undergoing mutation,while there were no frameshift mutations.The expressed protein was identified by using SDS-PAGE and Western blot,a new protein band was visible at the relative molecular mass of 38×103.ConclusionThe corresponding prokaryotic expression vector is successfully constructed,and the transpeptidase domain of PBP2a is successfully expressed and purified．

Key words:methicillin-resistant Staphylococcus aureus；mecA gene；penicillin binding protein 2a；transpeptidase domain

基金項目：福建省科技計劃社會發展重點項目(2012Y0058)。

作者簡介:馬洪玉，女，主管檢驗技師，主要從事臨床微生物與檢驗研究。 △通訊作者，E-mail：fzcmin@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.008

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0597-03

(收稿日期：2015-10-22)