肌紅蛋白在氧化鎳納米粒子中的固定及新型生物傳感器的制備

馬大威

(黃石市陽新縣第三人民醫院，湖北黃石 435000)

·臨床研究·

肌紅蛋白在氧化鎳納米粒子中的固定及新型生物傳感器的制備

馬大威

(黃石市陽新縣第三人民醫院，湖北黃石 435000)

摘要:目的對肌紅蛋白(Mb)在氧化鎳納米粒子中的固定情況和新型生物傳感器的制備情況進行探討。方法測試氧化鎳納米粒子改性石墨電極(GE)上Mb所表現出來的電化學情況，同時進行新型生物傳感器制備。結果Mb固定在Mb/氧化鎳(NiO)/二甲亞砜(DMSO)膜中時，其分子所具有的活性能夠得到更好的維持，其對H2O2具有電催化活性，且表觀米氏常數具體為0.21 mmol/L、靈敏度表現為417mA cm2L/mol,具有極高的親和性；Mb的檢出限表現為0.039 μmol/L。結論Mb存在明顯和穩定的氧化還原峰，Mb分子與電極間發生的電子傳遞受到DMSO的嚴重影響；將其固定于Mb/NiO/DMSO膜中時，更有利于其分子活性的維持，其對H2O2表現出高親和性。

關鍵詞:肌紅蛋白；氧化鎳納米粒子；新型生物傳感器

肌紅蛋白(Mb)為具有1個含鐵血紅素輔基和153個氨基酸的多肽鏈共同組合而成的一個亞鐵血紅素蛋白，其相對分子質量為17.5×103，其在機體中主要存在于心肌、骨骼肌等組織中[1]。加強對蛋白質電催化、直接電化學的深入研究，對認識機體電子轉移機制、相關具有生命物質在機體中的代謝情況等均具有極為重要的價值[2]。目前，諸多學者在研究過程中，利用納米材料、離子聚合物等進行組裝、交聯等之后，使血紅素蛋白質能夠被固定在電極表面，進而實現對Mb與電極存在的傳遞關系進行研究。本研究中主要對Mb在納米粒子上的固定情況進行探討，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料在本研究中，在石墨電極的表面進行氧化鎳(NiO)納米粒子修飾，然后將Mb固定于石墨電極的表面，進而實現對蛋白質在電極上所發生的直接電化學行為進行分析和研究。

1.2儀器與試劑本研究所應用到的相關儀器主要有：CHI660C電化學工作站(生產企業：上海辰華儀器公司)、Vector22FT-IR傅立葉紅外光譜(生產企業：Bruker公司)、掃描電子圖像分析儀(生產企業：德國Gemini公司)、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(生產企業：北京普析通用儀器有限責任公司)，此外還有石墨電極(GE)和飽和甘汞電極(SCE)。研究中所用的試劑主要有：M1882 Mb，研究所用水均為二次蒸餾水，使用到的其他試劑全部為分析純。研究過程中還需要溶液A、溶液B、溶液C共3種溶液；A種為Mb濃度為2.0 g/L水溶液；B種為NiO濃度為4.0 g/L二甲亞砜(DMSO)懸浮液；C種為溶液NiO濃度為4.0 g/L水溶液。

1.3方法(1)納米NIO制備：本研究主要應用氣相法中的噴霧熱分解法來實現納米NiO的制備；(2)電極制備：本研究所用石墨電極的面積為0.263 5 cm2。進行試驗之前，首先需對石墨電極進行打磨處理，然后使用氧化鋁(0.05 μm)在麂皮上繼續實施打磨操作，使其呈現出鏡面。在實施拋光操作之前，均須使用二次蒸餾水對電極進行徹底清洗。拋光操作結束之后需要依次使用丙酮、二次蒸餾水對電極進行超聲清洗，清洗的時間為5 min，清洗完畢后將其放置于室溫環境中晾干；(3)電極制備：本研究需進行6種電極的制備，其分別為裸電極、NiO/DMSO/GE電極、Mb/GE電極、Mb/NiO/GE電極、Mb/DMSO/GE電極、Mb/NiO/DMSO/GE電極。將所有電極放置于干燥瓶中，放置時間為2 h，使水分得到有效揮發，進而形成均勻膜。將電極放置于密封瓶中，放置時間為12 h，密封瓶恒溫為18 ℃。電極制成之后使用二次蒸餾水將其進行徹底沖洗，然后進行護理放置以備研究使用。測試方法：本研究應用的電極系統為三電極系統，首先將GE修飾成為工作電極，而輔助電極則為鉑絲，參比電極為SCE。電極系統設計好之后將其與電化學工作站進行連接，然后實施電化學測量試驗。在無特別說明的情況下，將相對于SCE的電位作為測量中的電位值均。實施循環伏安試驗的環境，須將恒溫控制在(18±0.2)℃的范圍內，且整個試驗須在靜止的電化學電解池中實施。在測試過程中，合理地將電解池溫度升高，且相應溫度位置保持時間為20 min恒溫，然后對循環伏安圖進行記錄。通過這樣的方法來實現對Mb/NiO/DMSO/GE所表現出來的實際穩定性進行分析。在實施試驗之前，需進行的相關電化學測試(均通過時間為15 min的純氮，將存在于電解液中的溶解氧去除)。在試驗實施的整個過程需始終保持處在氮的環境中。實施安培檢測操作時，將工作電位設置為-350 mV，將檢測所測得的電流-起始電流所得數值作為催化電流。在聚四氟乙烯片上分別滴上Mb，Mb/DMSO溶液，Mb/NiO/DMSO或Mb/NiO/H2O懸浮液，然后將聚四氟乙烯片放置于空氣中進行晾干，然后揭下膜，實施KBr壓片操作之后進行測試。將20次掃描所得結果的平均值制成每次測量的圖譜。分別在玻璃片上進行NiO修飾、Mb修飾、Mb/NiO/DMSO修飾，然后實施掃描電子圖像分析。

1.4統計學處理本研究所得相關數據均使用Microsoft Excel 2003進行統計學分析和處理。

2結果

當Mb混合到水、DMSO溶液、NiO/水懸浮液、NiO/DMSO溶液中時，Mb均能夠保持其原有的結構；將Mb固定在Mb/NiO/DMSO膜中時，更利于保持Mb分子的活性，且其天然結構也不會遭受破壞,其對H2O2具有電催化活性，且表觀米氏常數具體為0.21 mmol/L、靈敏度表現為417 mA cm2L/mol,具有極高的親和性，Mb的檢出限表現為0.039 μmol/L；當pH值在5～10范圍之內時，溶液pH值與式量電位表現出線性關系，其斜率為-42.3 mV/pH(r=0.999 3)，不僅接近于-43.9 mV/pH，同時也與291K時的理論值(-57.8 mV/pH)接近，這說明Mb的電子傳遞受溶液pH值影響。

3討論

Mb為一種氧結合蛋白，其在機體中主要存在于平滑肌、骨骼肌、心肌等組織中。存在肌肉中的所有蛋白中，Mb所占比例為2%左右[3]。Mb具有極小的相對分子質量，其相對分子質量僅為17.8×103，明顯小于肌酸激脢(CK-MB)和乳酸脫氫酶[4]。Mb位于細胞質的內部。在病理生理學中，存在于機體中的心臟標志物出現時間的早晚和分子在細胞中的部位、分子大小均存在密切聯系。相對分子質量越小，更易于其直接透過細胞存在的微小間隙，進入到血液中。所以當心肌損傷發生時，Mb會較早出現，目前，其為急性心梗出現之后能夠最早檢測得到的標志物。

當Mb處在溶液時，其對溶液的吸收均會存在一個吸收峰，這個吸收峰就是其在該種溶液中的Soret吸收帶[5]。但Soret吸收帶消失或者發生遷移時就提示蛋白質的結構出現了相應的變化。在Mb分子中，多肽鏈二級結構信息主要依靠酰胺Ⅰ、Ⅱ紅外吸收帶提供。在蛋白質失去活性時，其分子中的酰胺Ⅰ、Ⅱ所具有的特征吸收帶會發生明顯變化，吸收帶甚至會完全消失[6]。本研究結果顯示，當Mb固定在Mb/NiO/DMSO膜中時，其分子活性不易失去，且天然結構也不會發生明顯變化。

DMSO在蛋白質電子傳遞過程中發揮著極為重要的作用，導致這種現象出現的原因主要為DMSO能夠降低存在于Mb分子周圍環境中雙電層常數，進而降低了蛋白質電子在進行傳遞過程中外部重組能，最終導致蛋白質電子在傳遞過程中的速度不斷加快[7]。但是在Mb電子傳遞過程中，NiO納米粒子發揮著更加重要的作用，NiO納米粒子可創造出一個三維界面，這個三維界面能夠讓受限的方位同樣也適合蛋白質分子與電極表面間的直接電子傳遞，因此，蛋白質分子的電子傳遞會得到有效加快[8-9]。同時，NiO納米粒子具有強烈的吸附性，其更多的Mb會被其吸附，且將Mb吸附之后洗脫難度大，因此表現出較強的信號。

在本研究中，當將Mb/NiO/DMSO/GE在pH值為7.0的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)中進行連續性掃描時發現，其表現出來的標準偏差為0.887%，這個標準偏差表明Mb/NiO/DMSO修飾電極存在良好的重復性。當將修飾電極放置于恒溫為4 ℃，pH值為7.0的PBS中，放置時間為60 d，然后進行測試，測試結果顯示峰電流值是原來峰電流值的94%，這個結果表明Mb/NiO/DMSO/GE存在良好的穩定性。將蛋白質固定在導電性物質表面時，其出現的行為會和其所處于溶液中的行為發生一定的變化。熱力學穩定性試驗所得結果表明，Mb/NiO/DMSO/GE熱力學穩定性的增加與NiO納米粒子的存在具有密切聯系[10]。

溶液中的pH值對Mb直接電子傳遞存在明顯性影響。當溶液的pH值處于5～10的范圍之內時，溶液pH值和式量電位表現出明顯的線性關系，具有-42.3 mV/pH的斜率，該斜率接近于-43.9 mV/pH，同時也與291 K時的斜率理論值較為接近。這個結果表明，在電子傳遞過程過程中還有1個電子和1個質子參與。當溶液的pH值為7.0時，電子傳遞出現最高的峰電流值。因此在進行實驗時，所應用的電解質溶液通常會選擇pH值為7.0的PBS緩沖體系。

對于H2O2，Mb/NiO/DMSO/GE表現出明顯的電催化作用。當將H2O2加入到pH值為7.0的PBS中之后，還原峰電流會表現出明顯增加的趨勢，而氧化峰電流則表現出明顯減小的趨勢。這種現象在NiO/DMSO/GE上，或者在裸GE上均未出現。這種表明，H2O2所表現出來的催化還原作用主要是由于有Mb分鐘存在于電極上，且H2O2表現出來的催化效果具有明顯性。在本研究中，當在連續性地將適量的H2O2加入到pH值為7.0的PBS中時，在將工作電位選擇為-350 mV時，修飾電極對H2O2表現出較為理想的電催化活性，同時，在短短5 s的時間之內，穩態電流可高達95%。這個結果說明了電催化響應具有極快的速度，所以可有應用于H2O2的檢測，且會大大提高檢測的速度。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.045

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1404-03

(收稿日期：2016-01-03)