豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研究進展

馬 花，馬桂蘭，馬 祺，馬忠仁，柏家林，喬自林*

（1.西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅 蘭州 730010）

豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的研究進展

馬 花1，馬桂蘭2，馬 祺2，馬忠仁1，柏家林1，喬自林1*

（1.西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅 蘭州 730010）

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種豬的高致病性和高死亡率的疫病，給養豬業帶來了嚴重損失，目前尚無特別有效的免疫預防措施，接種疫苗仍是預防本病的最重要措施。滅活疫苗安全但保護力低，弱毒活疫苗有散毒風險但是保護力相對較高，DNA疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和基因缺失疫苗等新型疫苗研究都有較好進展。預防控制和消滅PRRS任重道遠。

豬繁殖與呼吸綜合征；滅活疫苗；弱毒活疫苗；基因工程疫苗

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的母豬繁殖障礙和新生仔豬呼吸道癥狀及死亡的疫病，也稱為豬藍耳病，是中國的輸入性疫病。1996年郭寶清等[1]從流產死胎中分離出PRRSV證實了中國也有PRRS。從2006年開始，PRRS在我國時常暴發，每年都會造成大量母豬生殖障礙和仔豬死亡，給養豬業帶來了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將PRRS列為B類傳染病，2008年我國農業部發布的新版《一、二、三類動物疫病病種名錄》中已將其列為一類動物疫病[2]。目前，PRRS尚無特別有效的免疫預防措施，接種疫苗仍是預防和控制本病的最重要措施之一。

1 PRRSV及特征

PRRSV主要有歐洲型和美洲型兩大類型，兩者核苷酸序列同源性只有60%左右，即使是同一個類型的不同株同源性也不高。在我國流行的主要是北美型PRRSV，屬于以JX-A1和Hu N4等為代表的亞群變異毒株[3-6]。第10次國際病毒大會將PRRSV歸到動脈炎病毒科動脈炎病毒屬的正單鏈RNA囊膜病毒。RNA基因組本身基因點突變、缺失、插入和替代的突變頻率很高，但在已知的RNA病毒中，PRRSV又是變異率較高的病毒之一。PRRSV在豬肺泡巨噬細胞、猴腎細胞MA-104和Marc-145上可增殖培養。PRRSV首先通過肺泡巨噬細胞內吞作用而感染易感動物引起病毒血癥，造成母豬生殖障礙和仔豬死亡，對養豬業存在巨大威脅[7]。

2 PRRS常規疫苗

目前市場上PRRS常規疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。

滅活疫苗是將PRRSV在細胞上大規模培養后用加熱或化學劑將病毒滅活后制成的死毒疫苗。Hanada[8]分析了過去十多年PRRSV的全基因序列后得出PRRSV病毒的進化率 (10-2/位/年)要明顯高于其他RNA病毒(10-3～10-5/位/年)，因此，選擇PRRS滅活疫苗生產用的毒株必須具有代表性，應與疫病流行地區分離毒株具有高度同源性。國外已有多種針對美洲型PRRSV株(ISU-P、VD-A11）和歐洲型PRRSV株(LV、VD-E1、VD-E2)的商品化滅活疫苗。國內PRRS疫苗研制起步較晚，2000年中國農科院哈爾濱獸醫研究所郭寶清等[9]以我國分離的流行毒株CH-1a為疫苗種毒株，利用Marc-145細胞轉瓶連續傳代培養獲得大量高滴度的PRRSV并研制出油佐劑滅活疫苗，該疫苗抗體達到高峰后可持續6個月左右，保護率可達 87.3%[10]。2007年山東齊魯保健品有限公司利用SD1株研制出滅活疫苗，并獲得了農業部的臨時生產文號，可用于緊急預防PRRS。同年，農業部獸醫診斷中心利用從疫區分離的JXA1株制成滅活疫苗，用以緊急預防PRRS，都為中國當時緊急防控PRRS疫情中起了重要作用。經過近十年的發展，國內已有十余家獸藥企業生產PRRS滅活疫苗。滅活疫苗的優點在于生產過程中工藝簡單、很少有活病原體污染，運輸與保存方便，動物免疫后不存在感染性病毒的問題。缺點在于免疫效果低，需多次免疫，免疫后誘導產生的免疫反應持續的時間較短，由于誘導的免疫反應水平較低，以及各個抗原成分之間的疫苗應答不平衡，還可能誘發其他疾病。

弱毒活疫苗是一種病原致病力減弱但仍具有活力和完整病原的疫苗，也就是用人工致弱或自然篩選的弱毒株，經培養后制備的活疫苗。2007年我國以CH-1a病毒株自主研制出了PRRS減毒活疫苗并獲批準[11]。2010年PRRS弱毒疫苗接種納入了國家強制免疫計劃，目前批準的弱毒活疫苗有湖南毒株（HuN4-F112）、江西毒株（JXA1-R）和天津毒株（TJM-F92）[12]。弱毒活疫苗應用到生產上最大的爭議在于弱毒株的毒力易返強，對一些極易感動物存在一定的危險性。在德國等歐洲國家禁止用活疫苗來預防PRRS，主要是采取捕殺的方法凈化豬群；美洲和亞洲國家提倡在未發生PRRS的豬場中避免使用弱毒活疫苗，而對于已發生PRRS的豬場免疫時可以采用弱毒活疫苗，但提倡的仍是滅活疫苗。劉海珍等[13]研究表明，首次免疫用弱毒疫苗，加強免疫用滅活疫苗或弱毒疫苗的保護率能達到80%以上，比首次免疫和加強免疫均用滅活疫苗的保護率高出40%以上，說明PRRSV弱毒活疫苗比滅活疫苗更有效。

3 PRRS基因工程疫苗

基因工程疫苗是指使用DNA重組技術，把天然的或人工合成的遺傳物質定向插入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞中，使之充分表達，經純化后制得的疫苗。基因工程疫苗種類繁多，主要有核酸疫苗、重組疫苗、活載體疫苗和基因缺失苗等。

DNA疫苗是應用基因工程技術把編碼保護性抗原的基因與能在真核細胞中表達的載體DNA重組，這種目的基因與表達載體的重組DNA可直接接種到動物體內，目的基因可在動物體內表達，刺激機體產生體液免疫和細胞免疫[14]。Pairzadeh B等[15]制備了針對PRRSV GP5蛋白的DNA疫苗，經小鼠和豬體免疫試驗都可檢測到中和抗體的產生。KwangJ等[16]制備了分別表達PRRSV的ORF4、ORF5、ORF6及ORF7結構蛋白的DNA疫苗并用于動物試驗，結果86%的豬產生了明顯的細胞免疫反應。通過ELISA、Western-blot檢測發現71%的豬產生了與N蛋白相關的病毒特異性抗體，試驗還證實ORF4和ORF5共表達的DNA疫苗刺激產生的抗體具有中和活性，表明該DNA疫苗可誘導體液免疫和細胞免疫的產生。中國農業大學研制的PRRSV-BJ24株GP5的DNA重組質粒，小鼠免疫和豬體免疫試驗都產生了較高的體液免疫和細胞免疫，產生較高水平的淋巴細胞增殖及NK細胞殺傷活性，攻毒后可使PRRSV陽性檢出率下降39%。程安春等將克隆的PRRSV SC2株ORF5基因載入pcDNA3.1載體，構建質粒pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5，運用真核表達系統表達，并進行免疫學試驗。結果證明該核酸疫苗可誘導實驗動物機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答，且免疫期時間可持續長達135 d以上[17]。隋慧等[18]根據PRRSV ORF5基因和PCV-2 ORF2基因成功構建的重組表達質粒pIRES-ORF2-ORF5免疫小鼠，結果顯示實驗小鼠的脾T淋巴細胞亞群數量與免疫滅活苗組相比顯著增強，顯示該二聯疫苗可誘導小鼠產生較強的體液免疫應答和細胞免疫應答。DNA疫苗尚未得到廣泛的應用，人們對它的最大顧慮就是它本身的安全問題，如外源DNA進入機體后是否整合到宿主基因組，導致癌基因激活或抑癌基因失活；疫苗DNA若整合到宿主基因組中表達后，是否會誘導機體產生免疫耐受，最終會不會導致機體的免疫力下降；疫苗DNA對機體而言是一種外來物質，是否會引起機體產生抗DNA抗體等。但是DNA疫苗同其他疫苗相比，DNA疫苗的生產工藝簡單，成分單一，免疫劑量小，安全性相對較高，因此，PRRS的DNA疫苗還是具有潛在的應用前景。

亞單位疫苗收集利用病毒表面結構成分制成的不含有核酸、能誘發機體產生抗體的疫苗，是依據主要保護性免疫原存在的組分而制成的疫苗，也叫組分疫苗。Prieto C等[19]用大腸桿菌為宿主的PRRSV GP5亞單位疫苗進行免疫攻毒試驗，結果表明免疫組豬群臨床癥狀明顯減輕、中和抗體含量有所提高，但是大腸桿菌中的目的基因表達后易形成包涵體，目的蛋白得不到修飾加工，限制了大腸桿菌表達系統的發展，最終被桿狀病毒表達系統和酵母真核表達系統所取代。錢洪喜[20]將構建的pPIC9k-ORF7重組質粒電轉入酵母細胞GS115中進行蛋白表達，SDS-PAGE結果顯示表達產物大小約為15 kD，結果表明N蛋白能與陽性血清發生反應，具有良好的反應原性。也有將基因轉入植物中制備出有效的新型亞單位疫苗，Hu Z J等[21]研制的含有PRRSV M蛋白的轉基因玉米口服小鼠，試驗結果表明小鼠產生較高水平的中和抗體和細胞因子。由于亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白質，接種可以避免產生無關抗原誘發的抗體，而且具有很好的免疫效果，但是亞單位疫苗存在免疫原性較低的缺點，需與佐劑合用才能產生好的免疫效果。

活載體疫苗是用基因工程技術將保護性抗原基因（目的基因）轉移到載體中使之表達的活疫苗。痘病毒、腺病毒和皰疹病毒等都是用于活載體疫苗制備的理想病毒載體。痘病毒的TK基因可插入大量的外源基因，大約能容納25 kb，而多數的基因都在2 kb左右，因此可在TK基因中插入多種病原的保護性抗原基因，制成多價苗或聯苗，是未來疫苗研制與開發的主要方向之一。CruzJ LG等[22]用豬傳染性胃腸炎病毒為載體表達野生型PRRSV的GP5和M蛋白，結果表明接種疫苗的動物比未接種動物產生更快、更強的體液免疫反應和細胞免疫反應。Shen G S等[23]構建了能表達PRRSV ORFSORF3和IL-18-ORF5-ORF3重組雞痘病毒活載體疫苗，對豬初免后21 d加強免疫，初免后60 d進行攻毒試驗，結果表明重組病毒能有效刺激豬外周血中T淋巴細胞的增殖和干擾素的產生，通過ELISA檢測和病毒中和試驗都可以檢測到針對PRRSV的特異性抗體。Han Y W等[24]研制出能表達PRRSVORF7的重組減毒沙門菌活載疫苗對豬進行免疫試驗，試驗結果表明豬口服ORF7沙門菌活載體疫苗后產生了ORF7特異性IgG抗體和黏膜IgA抗體；同時減毒沙門菌活載體還可以產生自身的免疫原性。活載體疫苗在免疫效果方面可以同時啟動機體細胞免疫和體液免疫，更具吸引力的是可以同時構建多價以至多聯疫苗，達到一苗防多病的效果。

基因缺失疫苗是用基因工程技術將強毒株毒力相關基因切除構建的疫苗。2012年，武華等[25]報道獲得了一種PRRSV基因缺失疫苗毒株TJM-F92，疫苗接種3 d后豬就產生了抗體，在短期內可迅速抵抗藍耳病自然感染，保護率達到80%以上，而且在豬的各生長期和生產期都可以接種該類疫苗。基因缺失疫苗安全性好、不易返祖，免疫力較強，免疫期長，尤其適用于局部接種，誘導產生黏膜免疫，其免疫接種與強毒感染相似，機體可對病毒的多種抗原產生免疫應答，是較理想的疫苗。盡管該類疫苗目前尚處于試驗研究階段，但為PRRS新型疫苗的研制開辟了新的方向。

4 展望

進入21世紀以來，在我國高度集約化養豬逐步替代了原有分散的小規模家庭養殖，對疫病防控要求更加嚴格，特別是高致病性藍耳病仍在流行，新的變異毒株不斷出現，防控形勢依然嚴峻。研制更為高效、安全的疫苗和建立科學的疫苗接種體系是控制和消滅藍耳病的重要措施。

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Q813.11

A

1006-799X(2016)19-0060-03

國家民委領軍人才計劃資助，甘肅省農業生物技術專項（GNSW-2014-24），西北民族大學中央高校基本科研業務費專項資金項目（31920150029）。

馬 花（1989-），女（回族），寧夏固原人，在讀碩士研究生，主要從事獸用生物制品研究和質量控制。

喬自林(1976-)，男，甘肅永靖人，高級實驗師，主要從事動物細胞培養技術研究。