大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF—2的克隆及結構分析

宋冰++付永平+李勃++趙海濤++李丹++王丕武

摘 要：大豆是我國重要的糧油經濟作物，是眾多行業中必需的原材料。鋅指蛋白是一種重要的轉錄因子，其中雙鋅指的植物C2H2型鋅指蛋白多數與植物的非生物脅迫相關，可以利用生物技術手段提高作物對非生物脅迫的耐受能力。該文利用生物信息學和同源克隆的方法克隆得到了大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2，并且利用軟件對其蛋白結構進行了初步分析。

關鍵詞：大豆；鋅指蛋白；STF-2；結構分析

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）03-04-18-03

Cloning and Structural Analysis of STF-2 Encoding a C2H2-type Zinc Finger Protein from Soybean

Song Bing1，2 et al.

（1Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2Jilin City Academy of Agricultural Sciences，Jilin 132101，China）

Abstract：Soybean（Glycine max[L.]Merrill）is the important food and oil crops of China which is the important raw materials of many industries.The zinc protein was an important transcription factors，and most plant C2H2-type zinc finger protein with the double zinc-finger structures related with adversity stress.It will offer a favorable condition to enhance the plants tolerance to adversity stress by the biotechnology. In this paper，a C2H2-type zinc finger protein gene STF-2 was isolated from soybean，and analyzed primary structure of the STF-2 by software.

Key words：Soybean；Zinc finger protein；STF-2；structural analysis

干旱、高鹽、低溫是限制植物生長發育的不利環境因子[1]。鋅指蛋白是轉錄因子的一種，其對植物的生長發育和非生物脅迫有著重要作用。根據以往的鋅指蛋白結構分析結果，可將鋅指蛋白分為C4、C2H2、C6、C4HC3等類型，其中大部分類型的鋅指蛋白都屬于C2H2型[2-3]。科學家們已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、矮牽牛（Petuniahy brida Vilm）以及水稻（Oryzas ativa）等植物中克隆得到了多個與植物非生物脅迫相關的C2H2型鋅指蛋白基因。例如，能使轉基因煙草明顯提高對冷及高鹽耐受能力的擬南芥STZ基因[3，4]；能提升耐旱能力的矮牽牛基因ZPT2-3；張紅生等克隆得到的水稻鋅指蛋白基因RZF71、RZF5，能夠提高轉基因作物對滲透脅迫的耐受能力[3，5-6]；能提高轉基因擬南芥對低溫的耐受能力的大豆鋅指蛋白基因sCOF-1[7]。相比之下，從擬南芥、水稻、矮牽牛等作物中克隆得到的鋅指蛋白基因均有10個左右，而得到功能驗證的大豆鋅指蛋白基因只有SCOF-1；GmZFP1是黃芳等克隆得到一個新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因，分析后發現其只有一個鋅指結構，推測與大豆的生長發育相關，與非生物脅迫無關[3，8]；白晶等從野生大豆中克隆得到了一個雙鋅指的C2H2型鋅指蛋白基因，但其氨基酸和核酸序列與sCOF-1同源性較高，且沒有進行相應的功能驗證[9]。本文利用大豆基因組數據庫和相關生物信息學軟件，采用同源克隆的方法克隆得到了一個新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2（GeneBank注冊號為：JQ74388），并利用生物信息學軟件對其蛋白結構進行了初步分析。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑 選用本實驗室自有品種“吉農17”的種子，單粒種植于紙杯中，放入的氣候箱（15h光照/9h黑暗）中25℃培養10d至4葉期，隨后連續7d不予澆水進行模擬干旱脅迫[3]，摘取處理后的大豆葉片，將其放入1.5mL離心管中，再放入液氮中以備大豆總RNA的提取。試驗中所用的RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、克隆載體pMD18-T均購自大連寶生物（TaKaRa）公司，目的基因的引物序列由上海（生工）生物工程公司合成，大腸桿菌E.colid H5α購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 將之前液氮凍存在離心管中的大豆葉片樣品研磨粉碎，利用吸附柱式RNA提取試劑盒提取大豆的總RNA，再利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA第一鏈，-20℃冰箱中保存備用[3]。

1.2.2 目的基因STF-2的克隆 利用已知的SCOF-1的氨基酸序列為信息探針，在GeneBank中運行tBlastn程序搜索對應的氨基酸序列，從中預測出若干具有C2H2型鋅指蛋白結構的大豆基因序列，本文選擇了一個命名為STF-2的基因進行克隆和相關蛋白結構分析。根據搜索出的cDNA序列再結合EST標簽庫中的數據，利用軟件拼接得到STF-2的基因序列，以其為模板設計引物：STF-2F（5'-GCTCATCTACACTCATA-3'），STF-2R（5'-TGATGAAAACAATTGTTA-3'）用于后續的基因克隆。使用之前反轉錄得到的cDNA為模板進行RT-PCR擴增，克隆目的基因，PCR反應程序如下：94℃預變性5min，94℃變性45s，48℃復性50s，72℃延伸50s，共進行32個循環，72℃后延伸10min，4℃保存[3]。經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物回收純化后連接至pMD-18T載體上，再轉化到大腸桿菌E.colid H5α中，之后將菌液送由上海生工公司進行測序。

1.2.3 染色體定位及蛋白結構初步分析 利用軟件primer5.5對目的基因STF-2的引物序列進行設計和分析，多個氨基酸序列的比較和系統發生樹采用的軟件是DNAMAN6.0和MEGA5.0。目的基因的染色體定位程序如下：首先，以STF-2的cDNA序列為搜索模板，在大豆基因組數據庫（http：//www.soybase.org）中運行blast程序進行比對，搜索得到目的基因在基因組中的具體位置，再分析目的基因在染色體上的遺傳距離，最后，根據染色體的物理圖譜將目的基因準確的定位在大豆染色體上。利用在線生物信息學軟件InterProScan對蛋白的二級結構進行了分析[3]。

2 結果與分析

2.1 STF-2基因的克隆和染色體定位 根據軟件預測和拼接的STF-2的cDNA序列設計特異引物，利用RT-PCR的方法從大豆品種“吉農17”中得到了大豆C2H2型鋅指蛋白基因STF-2，并用ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）分析目標序列確定其完整的開放閱讀框為747bp，如圖1。利用DNAMAN6.0分析其氨基酸序列，發現STF-2共編碼249個氨基酸，預測其等電點pI=8.23，分子量MW=26.7kDa。大豆基因組數據庫（http：//www.soybase.org）進行blast比對，發現STF-2基因定位在大豆第10（O）條染色體的長臂上，目的基因全序列都包含在一個編號為Glyma10g40400的序列之中，軟件也自動預測此基因序列編碼一個未知的C2H2型鋅指蛋白，其遺傳距離為117.2cm，再根據此序列的遺傳距離在10號染色體物理圖譜中確定其具體的位置，如圖2[3]。

2.2 STF-2蛋白的一級和二級結構分析 利用生物信息學軟件DNAMAN7.0將STF-2及水稻、擬南芥、矮牽牛、辣椒及大豆中典型的C2H2型鋅指蛋白的氨基酸序列進行多序列比對分析，結果表明，STF-2蛋白具有2個鋅指蛋白結構域，且兩鋅指間相隔36個氨基酸殘基，并且氨基酸序列特征符合典型鋅指結構所具有的氨基酸序列分布規律：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His，鋅指結構中都含有植物特有且保守的氨基酸序列QALGGH[3]。通過對氨基酸組成結構的分析表明，STF-2蛋白具有典型的植物C2H2型功能結構域，含有一個與亞細胞定位有關的核定位信號區NLS（也稱B-box），一個富含Leu的L-box，靠近C端的的DLN-box[10，11]，如圖3。利用MEGA5.0構建出STF-2和其他典型的植物C2H2鋅指蛋白的系統分化樹，可以看出大豆鋅指蛋白STF-2與SCOF-1、ZPT2-1、ZPT2-3等鋅指蛋白均屬于含有2個鋅指結構的植物C2H2型鋅指蛋白，這些典型的的植物C2H2型鋅指蛋白基因都與植物的非生物脅迫相關，且都具有雙鋅指結構，因此推測STF-2可能也與大豆非生物脅迫下的表達有關[3]，而STOP1、KNU等均為單鋅指的植物C2H2型鋅指蛋白，其大多與植物的生長發育相關，如圖4。利用InterProScan軟件對STF-2的二級結構進行了預測分析，通過對其蛋白的保守區域的分析發現，其具有2個保守的鋅指結構，紅色框選部位為其保守區域，更證實其為雙鋅指結構的鋅指蛋白，如圖5。

3 討論

STF-2基因是通過同源克隆的方法獲得的，根據以往的報道，大多數植物C2H2型鋅指蛋白都沒有內含子，經過測序分析后發現STF-2也沒有內含子[3，12]。通過各鋅指蛋白的氨基酸序列分析可以看出，STF-2氨基酸序列中具有2個典型的鋅指結構，且其中都含有典型的植物所特有的氨基酸保守序列QALGGH，雖然STF-2基因與SCOF-1基因都來源于同一種作物，但二者的核酸序列相似性僅為54.35%，氨基酸相似性為44.31%。除了2個鋅指結構外還有著相同的功能結構域：與亞細胞定位有關的核定位信號區NLS（也稱B-box），富含Leu的L-box，與轉錄抑制活性相關的DLN-box，更可以證明STF-2是一個新的大豆C2H2型鋅指蛋白基因。通過對STF-2二級結構的分析表明，其2個鋅指結構均由α螺旋和β折疊圍繞一個鋅離子構成。鋅指蛋白作為轉錄因子起到調控作用，主要通過鋅指結構與DNA相結合，再調控下游基因的表達；經過電荷分布情況的分析表明，STF-2的鋅指結構帶有負電荷，而DNA具有正電荷，表明其可以與DNA相結合，這也是鋅指蛋白發揮作用的基礎，這一結果也與以往的報道相符[12]。

已知的植物C2H2型鋅指蛋白一部分類型參與了植物生長周期中的表達調控，另一部分則與逆境脅迫下基因的表達調控有關。根據以往的研究可知：具有1個鋅指結構的植物C2H2型鋅指蛋白與植物的生長發育，尤其是生殖器官的發育有關，如典型的單鋅指基因SUPERMAN、PhSUPI、KNU等，而具有2個鋅指結構的植物C2H2型鋅指蛋白大多與各種非生物脅迫相關[3，11]，如典型的植物雙鋅指基因STZ/ZAT10、ZPT2-2、ZPT2-3、SCOF-1等[3，13]。研究人員發現：在干旱脅迫下，矮牽牛ZPT2-2被誘導表達，從而提高了轉基因植物的抗旱性。根據ZPT2-2的氨基酸序列進行同源性比對，科學家分離得到了ZPT2-3，經過試驗分析表明，ZPT2-3受低溫，干旱、茉莉酸和重金屬誘導并不受ABA誘導，且轉ZPT2-3基因的矮牽牛在20%的PEG6000溶液脅迫處理下，比對照表現出明顯的抗旱性[3，12]；系統進化樹進一步表明，STF-2基因與ZPT2-3、STZ、ZPT2-3、SCOF-1基因的都同屬雙鋅指結構的植物C2H2型鋅指蛋白，軟件分析表明它們都具有相同的功能結構域，因此推測STF-2是與非生物脅迫相關的C2H2型鋅指蛋白基因。研究表明，SCOF-1基因表達后，通過SGBF-1介導調控COR（低溫調控基因）的表達來提升轉基因植物的耐冷性[3，7]，但STF-2的調控機制還不清楚，具體的調控路徑和生物學功能還需要作進一步的研究分析。

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（責編：張宏民）