有氧運動對小鼠心功能及熱休克蛋白的影響*

蔡穎，徐玉生，鄭璠，沈玄霖，頓耀山，劉遂心

（中南大學湘雅醫院 康復科，湖南 長沙 410008）

心血管疾病已經成為全世界所面臨的最嚴重公眾健康問題,據2014年《中國心血管病報告》顯示，心血管疾病是我國居民首要死亡原因。研究證實，運動訓練可改善心血管病患者的心臟功能，降低心血管疾病患者的再住院率、再發心血管事件率和死亡率[1]。近年來，已有研究報道運動訓練對于哺乳動物和人類心臟功能的影響，但運動對心肌保護的確切機制尚不十分清楚。

熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）又稱應激蛋白（stress proteins,SPs），是一類在應激狀態下如高溫大量合成的蛋白[2-3]。熱休克蛋白結構保守，功能廣泛。研究發現，在哺乳類動物中熱休克蛋白主要有HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、HSP27和αβ-晶狀體蛋白等多種基因型。熱休克蛋白的心肌保護作用已研究甚多，大量研究證實熱休克蛋白中HSP27、70、90以及αβ-晶狀體蛋白能夠參與炎癥反應、細胞凋亡信號轉導途徑、抗自由基和減少鈣超載等多個反應機制，從而在高溫和缺血等應激狀態下對心肌起保護作用[3-6]。然而，目前關于運動訓練對心肌熱休克蛋白表達影響的研究比較少見。本研究觀察12周有氧運動對小鼠心臟功能以及心肌熱休克蛋白表達的影響，進一步探討有氧運動訓練對心肌保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

中南大學湘雅醫學院動物實驗中心提供的健康雄性昆明小鼠16只，體重22～30 g，隨機平均分為運動組和對照組。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 運動組小鼠（8只）運用ZH-PT小鼠跑臺（安徽淮北正華公司）給予平板跑步訓練，總干預時間為12周，每周運動5 d，休息2 d。運動干預前后兩組小鼠均行心臟超聲檢查以觀察心臟結構和功能的變化。12周運動干預后，麻醉處死小鼠，取小鼠心臟左室中部心肌行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE染色法）觀察心肌細胞結構的變化，取左室上部心肌采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription PCR,RT-PCR）觀察心肌細胞心肌熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）信使RNA（mRNA）的表達。

1.2.2 運動組小鼠干預措施 正式運動干預前給予10 min/d，速度為5 m/min，坡度為0%適應性訓練5 d。休息2 d后正式開始運動訓練，起始跑速為10 m/min，時間20 min，跑臺傾角0°。隔日增加運動時間10 min；每周增加跑速1 m/min，跑臺傾角增加1°，直到跑速增至15 m/min，時間增至60 min，跑臺傾角增至6°，維持以上運動強度直至運動訓練結束。運動組小鼠每天均在同一時間予以跑步訓練，訓練時對照組小鼠放置跑臺邊，用以平衡其他干擾因素。對照組小鼠除不予以平板運動訓練外，其余實驗步驟同運動組。

1.2.3 小鼠心臟彩超 腹腔麻醉各組小鼠，采用Vevo 770小動物高分辨超聲儀（加拿大Visual Sonics公司）觀察小鼠心臟結構和功能，采用10S探頭（最大頻率11.5 MHz，中心頻率10 MHz）對小鼠心臟進行掃查，圖像深度調至2.0～4.0 cm。在小鼠左心室長軸切面上測量并記錄左室內徑厚度（LV）、室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）、左室重量指數（左室重量/體表面積，LVMI）和通過M型超聲測算左室射血分數（EF），所有數據測量3次后取其平均值并記錄。

1.2.4 標本采集及處理 腹腔麻醉處死各組小鼠，在滅酶條件下快速分離小鼠左心室游離壁，取小鼠左心室中部組織置于10%甲醛溶液中，固定24 h后制作石蠟切片，給予HE染色法并在光學顯微鏡下觀察小鼠心肌組織病理學改變。取小鼠左心室上部組織置于凍存管，液氮凍存后予RT-PCR檢測小鼠心肌熱休克蛋白的表達。

1.2.5 檢測心肌熱休克蛋白表達 采用內參比法RT-PCR（德國Eppendorf PCR儀）檢測HSPs mRNA的表達。取小鼠左心室心肌組織，提取總RNA，測定其含量及純度后進行互補DNA（cDNA）合成。取cDNA 4 μl作為模板，依次加入10 μM的上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，然后進行目的基因聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）。總反應體系為10 μl，HSP27的反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；HSP70的反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；HSP90的反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；αβ-晶體蛋白的反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；GAPDH的反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共22 cycles，72℃延伸10 min，4℃保存；β-actin的反應條件為95℃預變性4 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 cycles，72℃延伸8 min，4℃保存。最后將PCR產物在60 V恒壓下給予40 min電泳（BioRad公司電泳儀），用TANON GIS2020凝膠分析儀（上海天能科技有限公司）數碼拍照，Image-pro plus v 6.0圖像分析軟件對電泳結果予半定量分析。

表1 引物設計表

1.2.6 引物設計 在GeneBank中查詢小鼠目的基因mRNA序列后通過Primer Premier 5軟件設計引物，見表1。

1.2.7 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示；用Levene檢驗數據方差齊性，P＞0.05認為方差齊性；兩樣本均數比較采用t檢驗；Spearman相關分析兩變量間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠心臟彩超指標情況比較

心臟超聲結果顯示，運動組小鼠心臟左室內徑（LV）較對照組明顯減小（P＜0.05）；運動組小鼠心臟室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）較對照組明顯增加（P＜0.05,P＜0.01）；左室重量指數（LVMI）、射血分數（EF）較對照組明顯增加（P＜0.05,P＜0.01），見表2。

表2 TEP組與TAPP組相關指標比較 （±s）

表2 TEP組與TAPP組相關指標比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.01。

組別 例數 LV/mm IVS/mm LVPW/mm LVMI/(g/cm2) EF/%對照組 8 2.17±0.30 0.80±0.09 0.79±0.09 0.52±0.17 81.6±7.26運動組 8 1.71±0.372） 1.22±0.132） 1.28±0.302） 0.83±0.261） 90.0±3.162）t值 2.73 7.51 4.42 2.82 3.00 P值 0.018 0.030 0.000 0.013 0.009

2.2 兩組小鼠左心室游離壁光鏡檢查

運動組小鼠心肌與對照組相比纖維排列整齊、體積明顯增粗、細胞明顯增大且邊緣變鈍，見圖1、 2。

2.3 RT-PCR法檢測兩個組小鼠心肌HSPs mRNA的表達

RT-PCR結果示HSP70、90、27和 aβ-晶狀體蛋白陽性信號分別在300 bp、320 bp、533 bp和610 bp出現，內參GADPH在588 bp出現，β-actin在210 bp出現見圖3～6。運動組小鼠心肌HSP27、70、90和αβ-晶狀體蛋白mRNA表達明顯高于對照組小鼠，兩組小鼠心肌HSP27、70、90和αβ-晶狀體蛋白mRNA表達比較差異有統計學意義，見表3。

圖1 對照組心肌

圖2 運動組心肌

圖3 RT-PCR 法檢測HSP70mRNA

圖4 RT-PCR 法檢測HSP90mRNA

圖6 RT-PCR 法檢測aβ-晶狀體蛋白

表3 兩組小鼠心肌HSPs mRNA表達的比較 （±s）

表3 兩組小鼠心肌HSPs mRNA表達的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.01。

組別 例數 HSP70 HSP90 HSP27 αβ-晶體蛋白對照組 8 0.59±0.24 0.65±0.31 0.98±.054 0.84±0.39運動組 8 2.36±0.321）2.29±0.471）2.15±1.222）2.16±0.452）t值 12.51 8.23 2.71 6.27 P值 0.030 0.025 0.002 0.001

3 討論

本研究中的小鼠從運動方式、強度、持續時間及頻率等方面模擬人體的有氧運動訓練，采用12 周逐漸遞增的運動訓練[7-8]，直到跑速至15 m/min,跑臺傾角6°，運動時間至60 min,并維持以上運動強度至跑臺訓練結束，實驗結果顯示此運動訓練方法安全有效。

大量基礎研究發現長期的中等強度運動訓練可引起心臟發生一系列的適應性改變，比如心臟生理性的肥厚，心肌纖維收縮功能增強，最大心搏量的增加以及心臟對缺血再灌注損傷的保護效應增加等保護功能[9]。臨床實踐中，研究者發現在注意患者安全和加強監護的前提下,盡量達到運動處方的運動量,運動訓練能改善心血管疾病患者心臟的功能,提高其生活質量[10]。本研究結果顯示，經過12 周的有氧運動干預，運動組小鼠心臟左室內徑明顯減小，心臟室間隔厚度、左室后壁厚度及左室重量指數明顯增加，說明有氧運動能引起小鼠心臟生理性的肥厚；左室射血分數明顯增加，說明小鼠心臟泵血功能增強。同時小鼠心肌標本HE染色光鏡顯示運動組小鼠心肌細胞排列有序，細胞體積明顯增大，心肌纖維增粗，進一步確認有氧運動能夠引起小鼠心臟生理性肥厚。本研究從心臟形態學、病理檢查等多方面論證，長期中等強度有氧運動訓練能夠引起小鼠心臟生理性的肥厚，增強心肌收縮功能，改善心臟供血功能。這些結果與國內外研究成果一致[11-13]，運動訓練確實能改善心臟功能。運動組小鼠心肌HSP27、HSP70、HSP90和aβ-晶狀體蛋白mRNA表達均明顯上調，說明有氧運動能夠引起小鼠心肌熱休克蛋白mRNA的表達。金怡等[14]的研究發現低等強度運動訓練能夠誘導熱休克蛋白表達的增加，但是高等強度運動則減少了熱休克蛋白的表達，不能有效抑制心肌細胞凋亡，不利于心肌的保護作用。與之相反的是，胡亞哲等[15]報道高等強度有氧運動訓練后，心肌細胞HSP70表達增加的更明顯。他認為隨著運動強度的增加，機體內環境更加紊亂，變性蛋白質增加的更明顯，進而誘導熱休克蛋白mRNA表達增加的更明顯。中等強度是目前絕大多數研究采用的運動訓練強度，本研究采用的就是中等強度的有氧運動。本研究發現12周中等強度的有氧運動可以引起小鼠心肌HSP27、HSP70、HSP90和aβ-晶狀體蛋白mRNA表達的明顯上調，這與Demirel等[16]的研究結果一致。Demirel等發現10～12周中等強度（65%～75% VO2max,60 min/d）的跑臺訓練后，大鼠心肌熱休克蛋白水平較前增加5倍。從本研究結果來看，長期中等強度有氧訓練可以引起熱休克蛋白表達明顯升高。

熱休克蛋白在正常狀態下普遍表達,在機體應激的情況下表達明顯增加。熱休克蛋白的過度表達,能夠保護心肌缺血時細胞微管、肌動蛋白骨架和內皮細胞的完整性；能阻礙心肌細胞凋亡；并能參與蛋白激酶和轉錄因子的折疊和激活，參與黏附NO合成酶以及刺激其活性,還能下調其細胞因子產物。Vander等[17]研究發現,提高犬心肌細胞HSP27的表達能夠降低再灌注后對心臟功能和心肌代謝的敏感性。Jayakumar等[18]研究表明,熱休克蛋白HSP70可以在缺血/再灌注情況下保護心肌細胞免受氧化應激損傷。另一方面，Christians等[19]認為HSP70可能通過阻止線粒體細胞色素C的釋放從而抑制細胞的凋亡。Kupatt等[20]認為熱休克蛋白HSP90的過度表達可以明顯減少心肌缺血/再灌注損傷,而這種作用主要是通過激發內源性-氧化氮途徑實現的。此外，Liu等[21]發現αβ-晶狀體蛋白可抑制Bid活化，抑制Cyt C釋放，與CytC、P53和Bax等蛋白相互作用從而抑制心肌細胞凋亡。本研究結果中運動組小鼠心臟功能增強，心肌細胞HSP27、HSP70、HSP90和αβ-晶狀體蛋白mRNA表達上調，說明有氧運動訓練增強心肌保護作用的機制可能與心肌熱休克蛋白（HSPs）mRNA表達的上調有關。其具體的機制可能為調節蛋白的合成、折疊、運輸和降解過程，調節抗氧化酶的活性，保護線粒體和質膜結構的穩定性，通過抑制細胞色素酶C的釋放以及對Bcl-2的穩定作用實現對細胞凋亡的抑制，減少細胞凋亡，修復受損的細胞結構，維持細胞的穩定性，參與激活應激性核轉錄因子，比如HSP90可以激活缺氧誘導因子(HIF-1α)。在組織缺氧時，HIF-1α因子可繼續誘導糖酵解酶A、乳酸脫氫酶A和磷酸果糖激酶-1等糖酵解酶以及血管內皮生長因子、HO-1及NOS等分子的基因轉錄,增強組織耐缺氧能力[22]。

綜上所述，長期中等強度有氧運動可引起小鼠心肌肥厚，心功能增加。其機理可能與有氧運動訓練誘導小鼠心肌細胞HSPs表達上調有關。

[1]丁榮晶.心血管病患者運動處方的制定[J].中華全科醫師雜志,2014(5):331-333,334.

[2]Snoeckx LH,Cornelussen RN,Nieuwenhoven FAV,et al.Heat shock proteins and cardiovascular pathophysiology[J].Physiological Reviews,2001,81(4):1461-1497.

[3]Latchman DS.Heat shock proteins and cardiac protection[J].Cardiovascular Research,2001,51(4):637-646.

[4]Jayakumar J,Suzuki K,Khan M,et al.Gene therapy for myocardial protection:transfection of donor hearts with heat shock protein 70 gene protects cardiac function against ischemia-reperfusion injury[J].Circulation,2000,102(19Suppl3):302-306.

[5]Cumming DV,Heads RJ,Watson A,et al.Differential protection of primary rat cardiocytes by transfection of specific heat stress proteins.[J].Journal of Molecular & Cellular Cardiology,1996,28(12):2343-2349.

[6]Dillmann W H.Heat shock proteins and protection against ischemic injury[J].Infectious Diseases in Obstetrics & Gynecology,1999,7(6):55,57.

[7]Angelis KD,Wichi RB,Jesus WRA,et al.Exercise training changes autonomic cardiovascular balance in mice.[J].Journal of Applied Physiology,2004,96(6):2174-2178.

[8]Desai KH,Sato R,Schauble E,et al.Cardiovascular indexes in the mouse at rest and with exercise:new tools to study models of cardiac disease[J].American Journal of Physiology,1997,272(2):H1053.

[9]Boluyt MO,Loyd AM,Roth MH,et al.Activation of JNK in rat heart by exercise:Effect of training[J].Ajp Heart & Circulatory Physiology,2004,285(6):H2639-H2647.

[10]Mezzani A,Hamm L F,Jones AM,et al.Aerobic exercise intensity assessment and prescription in cardiac rehabilitation:a joint position statement of the European Association for Cardiovascular Prevention and Rehabilitation,the American Association of Cardiovascular and Pulmonary Rehabilitation,and the Canadian Association of Cardiac Rehabilitation[J].Journal of Cardiopulmonary Rehabilitation &Prevention,2012,32(6):327-350.

[11]Weiner RB,Baggish AL.Exercise-induced cardiac remodelling:the need for assessment of regional myocardial function.[J].Journal of Physiology,2012,590(Pt12):2829-2830.

[12]Hyo-Bum K,Wook S,Lawler JM.Exercise training attenuates ageinduced elevation in Bax/Bcl-2 ratio,apoptosis,and remodeling in the rat heart[J].Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology,2006,20(6):791-793.

[13]Brown MD.Exercise and coronary vascular remodelling in the healthy heart[J].Experimental Physiology,2003,88(5):645-658.

[14]金怡,江鐘立,招少楓,等.低強度運動對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的保護作用[J].中國康復醫學雜志,2009,24(1):15-19.

[15]胡亞哲,陳艷,扈詩興,等.運動訓練誘導大鼠心肌細胞熱休克蛋白70表達[J].中國運動醫學雜志,2009,5(28):561-563.

[16]Demirel HA; Powers SK; Caillaud C,et al.Exercise training reduces myocardial lipid peroxidation following short-term ischemiareperfusion[J].Medicine & Science in Sports & Exercise,1998,30(8):1211-1216.

[17]Vander HRS.Increased expression of HSP27 protects canine myocytes from simulated ischemia-reperfusion injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282(3):935-941.

[18]Jayakumar J,Suzuki K,Sammut IA,et al.Heat shock protein 70 gene transfection protects mitochondrial and ventricular function against ischemia-reperfusion injury[J].Circulation,2001,104(12):I303-I307.

[19]Christians ES,Yan LJ,Benjamin IJ.Heat shock factor 1 and heat shock proteins:Critical partners in protection against acute cell injury[J].Critical Care Medicine,2002,30(1 Supp):S43-S50.

[20]Kupatt C,Dessy C,Hinkel R,et al Heat Shock Protein 90 Transfection Reduces Ischemia-ReperfusionCInduced Myocardial Dysfunction via Reciprocal Endothelial NO Synthase Serine 1177 Phosphorylation and Threonine 495 Dephosphorylation[J].Arteriosclerosis Thrombosis& Vascular Biology,2004,24(8):1435-1441.

[21]Liu S,Li J,Tao Y,et al.Small heat shock protein alphaB-crystallin binds to p53 to sequester its translocation to mitochondria during hydrogen peroxide-induced apoptosis[J].Biochemical & Biophysical Research Communications,2007,354(1):109-114.

[22]Semenza GL.HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing[J].Current Opinion in Cell Biology,2001,13(2):167-171.