南京地區兒童患者肺炎鏈球菌的血清型分布

苗丹青，徐飛，李軍強，劉婧筠，邵忠琦，朱濤，鐘天鷹

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.江蘇省南京市兒童醫院 檢驗科微生物室，江蘇 南京210008；3.天津康希諾生物技術有限公司，天津 300457；4.江蘇省南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004）

肺炎鏈球菌是一種重要的人類致病菌，可以引起肺炎、腦膜炎及中耳炎等多種疾病。世界衛生組織估計每年大約有160萬人死于肺炎鏈球菌的感染[1]。肺炎鏈球菌的致病性與其莢膜密切相關。根據其莢膜多糖的抗原特性不同，目前已發現46個血清群，90余種血清型[2]。但多數血清型不致病或致病力很弱，僅有少數致病力較強。故而肺炎鏈球菌血清型流調是評估多價疫苗適用性的必要標準[3]。由丹麥血清研究所（Statens Serum Institut,Denmark）開發的莢膜腫脹和乳膠凝集試劑盒是目前血清型檢測使用的傳統方法，但其抗血清的價格昂貴且不利于菌株的批量檢測。Pai等[4]開發的多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）分離樣本進行血清分型方法提高了分型的效率。近年來，隨著肺炎鏈球菌莢膜多糖的生物合成基因序列的公布，利用分子學手段進行分型的技術正在逐步走向成熟[5]。

本實驗采用多重PCR的方法，對來自兒童患者體內的肺炎鏈球菌的臨床分離株進行血清型鑒定，以確定肺炎鏈球菌血清型的分布情況，為13價肺炎結合疫苗的開發提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有323株肺炎鏈球菌臨床分離株均由南京市兒童醫院檢驗科微生物室提供，分別于2007年11 月-2011年7月從兒童患者中獲得。其中56株是從患者體液內分離得到的菌株，這些患者的臨床診斷結果約有50%為肺炎，其余的為中耳炎、化膿性腦膜炎等。由于這些菌株來自于患者體內，故而為侵襲性菌株。其余的267株是從患者的痰液中分離得到的，為非侵襲性菌株。

含10%羊血的哥倫比亞瓊脂培養基（Columbia Blood Agar Base,購自OXOID）；三磷酸脫氧核糖苷酸（dNTPs）和DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；引物購自Invitrogen Trading（產地：上海）其他的化學試劑均為國產的分析純試劑。

1.2 菌體裂解液的制備

將肺炎鏈球菌的臨床分離株涂布于血平板上，于37℃，5%二氧化碳（CO2）培養箱中培養16～20 h[6]。用生理鹽水收集平板上的菌體，混勻，離心。將所得菌體用30 μl TE buffer重懸（10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0），沸水浴5 min以保證菌體充分裂解，將菌體裂解液于-80℃保存備 用[7]。

1.3 PCR方法

用于血清分型的30對PCR引物序列引用參考文獻[4]設計。以肺炎鏈球菌細胞裂解液中的DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μl，其中包括純化水 15.5 μl，PCR 引物共 2.5 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTPs 2 μl，DNA聚合酶0.5 μl，模板DNA（肺炎鏈球菌的菌體裂解液）2 μl。PCR反應條件如下：95℃ 4 min，95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環，72℃ 10 min，最終降溫至4℃。

1.4 PCR產物鑒定

在1.5%瓊脂糖凝膠上對所得PCR產物進行凝膠電泳分析，瓊脂糖凝膠的配置和電泳緩沖液菌均采用1×TAE buffer（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.0）。根據獲得的DNA條帶大小確定菌株的血清型。

2 結果

2.1 PCR血清分型的條件優化

2.1.1 模板處理方式的優化 本實驗比較了模板的不同處理方式對PCR結果的影響，分別以肺炎鏈球菌菌體和菌體裂解液為模板進行PCR擴增。以14型為例，如圖1所示以全菌體為模板時第5組引物無產物，第7組產物條帶也較為模糊，而以菌體裂解液為模板時各組產物均成功擴增。結果表明采用菌體裂解液為模板更有助于肺炎鏈球菌cspA基因的擴增。

2.1.2 退火溫度的優化 退火溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，為了比較不同退火溫度對PCR結果的影響，本實驗將退火溫度分別設為50℃、52℃和54℃，其他條件不變分別進行PCR擴增。如圖2所示，結果發現退火溫度過低（50℃）非特異性條帶較多，對最終血清型的確定產生干擾；退火為52℃或54℃均可特異性擴增出肺炎鏈球菌莢膜多糖條帶和分型條帶，但鑒于退火溫度過高特異性過強不利于目標條帶的擴增，故而將最佳退火溫度設為52℃。

2.2 樣本血清分型鑒定結果

此次實驗通過PCR的方法分析了323株肺炎鏈球菌臨床分離株。PCR分型試驗結果如圖3所示。其中血清型19 F、19 A、14和6 A/B型最為常見，所占的百分比分別為31.3%（101/323）、13.3%（43/323）、12.7%（41/323）和10.8%（35/323），有26株未能分型。根據此鑒定結果，推斷7價肺炎結合疫苗的覆蓋率約為62%，而13價肺炎結合疫苗（PCV13）的血清型覆蓋率較高約為85%。

2.3 侵襲性肺炎鏈球菌病例分型結果

從患者體內（包括膿液，血液，腦脊液，胸水，分泌物，胸腔積液，支氣管肺泡灌洗液等）分離得到的菌株，臨床診斷結果約有50%為肺炎，其余的為中耳炎、化膿性腦膜炎等。來自于患者體內的肺炎菌株認定為侵襲性菌株。待測樣本中侵襲性菌株共56株，血清分型結果如圖4所示。其中19 F、14、19 A、3和6 A/B所占比例較高，分別為37.5%、23.2%、10.7%、7.1%和5.4%，其它7個血清型分別為1、8、17 F、18、20、23 F和33 F，共占16.1%。

非侵襲性菌株共267株，分型結果如圖5所示。血清型以19 F、19 A、6 A/B、14和3型為主，所占的比例分別為30.0%、13.5%、12.0%、10.5%和5.6%，有26株未能分型。本次實驗結果表明，患者感染侵襲性肺炎鏈球菌和非侵襲性肺炎鏈球菌的主要血清型相同，均為19 F、14、19 A、3和6 A/B。這5個血清型共占的比例分別為侵襲性菌株83.9%和非侵襲性菌株71.6%。

圖1 模板的不同處理方式對PCR結果的影響

圖2 退火溫度的優化

圖3 肺炎鏈球菌臨床分離株血清型的分布

圖4 侵襲性肺炎鏈球菌分離株的血清型分布

圖5 非侵襲性肺炎鏈球菌分離株的血清型分布

3 討論

肺炎鏈球菌在自然界中分布廣泛，主要寄生在人的鼻咽部，通過飛沫在人與人之間傳播。約有5%～10%的健康成人及20%～40%兒童的鼻咽內帶菌,當機體免疫功能較低時病菌就會趁虛而入造成肺炎。目前市場上預防肺炎球菌的疫苗主要有兩大類：23價肺炎多糖疫苗和7價多糖蛋白結合疫苗。這些疫苗的開發對肺炎鏈球菌類疾病起到了很好的控制作用，但隨著菌株的變異肺炎鏈球菌血清型逐漸增加，現有疫苗覆蓋率不斷降低，且存在地區差異[8]。肺炎多糖疫苗的成本較高、生產工藝復雜且多糖疫苗無法保護嬰幼兒，而2歲以下的嬰幼兒恰恰是的肺炎鏈球菌感染的高危人群，所以肺炎結合疫苗的開發將是預防嬰幼兒肺炎鏈球菌類疾病的主要手段。故而建立一種新的簡便快捷的方法來鑒定各個地區的肺炎鏈球菌的血清型，對于評估現有肺炎疫苗的覆蓋率和開發新的結合疫苗顯得尤為重 要。

相比于傳統方法連續多重PCR技術為肺炎鏈球菌血清型的確定提供了一種更加簡單、經濟的方法，可以更有效地適應檢測各個地區的血清型，為當地肺炎疫苗的覆蓋率提供科學依據。目前南非、西班牙等多個國家已采用多重PCR的方法對該地區兒童和成人患者體內的臨床分離株進行了血清分型，并選取若干鑒定結果進行測序，測序結果顯示與mPCR結果保持一致[9-10]。

本研究建立了多重PCR進行肺炎臨床分離株血清分型試驗方法，并確定了南京地區兒童患者所攜帶的肺炎鏈球菌的血清型，為肺炎疫苗的開發和選擇提供了重要依據。

[1]Mahoney RT,Krattiger A,Clemens JD,et al.The introduction of new vaccines into developing countries IV:global access strategies[J].Vaccine,2007,25(20):4003-4011.

[2]Henrichsen J.Six newly recognized types of Streptococcus pneumonia[J].J Clin Microbiol,1995,33(10):2759-2762.

[3]Kyaw MH,Lynfield R,Schaffner W,et al.Effect of introduction of the pneumococcal conjugate vaccine on drug-resistantStreptococcus pneumoniae[J].N Engl J Med,2006,354(14):1455-1463.

[4]Pai R,Gertz RE,Beall B.Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates[J].J Clin Microbiol,2006,44(1):124-131.

[5]Stephen DB,David MA,Angeliki M,et al.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes[J].PLoS Genet,2006,2(3):e31.

[6]Hollingshead SK,Baril L,Ferro S,et al.Pneumococcal surface protein A (PspA) family distribution among clinical isolates from adults over 50 years of age collected in seven countries[J].J Med Microbiol,2006,55(Pt2):215-221.

[7]Lawrence ER,Griffiths DB,Martin SA,et al.Evaluation of semiautomated multiplex PCR assay for determination of Streptococcus pneumoniae serotypes and serogroups[J].J Clin Microbiol,2003,41(2):601-607.

[8]Hausdorff WP,Van Dyke MK,Van Effelterre T.Serotype replacement after pneumococcal vaccination[J].The Lancet,2012,379(9824):1387-1388.

[9]Morais L,Carvalho MG,Roca A,et al.Sequential multiplex PCR for identifying pneumococcal capsular serotypes from south-Saharan African clinical isolates[J].J Med Microbiol,2007,56(9):1181-1184.

[10]Iraurgui P,Torres MJ,Gandia A,et al.Modified sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of invasive pneumococci recovered from Seville[J].Clin Microbiol Infec,2010,16(9):1504-1507.