血吸蟲核酸診斷方法研究進展*

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·綜述·

血吸蟲核酸診斷方法研究進展*

孫莉軍1，葉青2，趙友云3，齊自慧2，楊夢歌2#綜述,王業富2△#審校

(1.湖北省臨床檢驗中心，湖北武漢 430064；2.武漢大學生命科學學院病毒學國家重點實驗室，

湖北武漢 430072；3.湖北省中醫院，湖北武漢 430061)

關鍵詞:血吸蟲病；早期診斷；核酸診斷

血吸蟲病是由裂體吸蟲屬血吸蟲引起的一種熱帶性疾病。主要通過接觸血吸蟲疫水，尾蚴經接觸部位的皮膚、黏膜侵入人體而造成感染。根據WHO報告，全世界有超過2億人感染血吸蟲病，孩童的感染率高于成人，我國是日本血吸蟲病流行最嚴重的4個國家之一。血吸蟲病的診斷通常是通過顯微觀察排泄物中的蟲卵來確定[1]。但這種方法的靈敏度不高，糞便中排出蟲卵分布不均勻和排出量的波動性會對結果的準確性造成影響[2]。現行主要的血吸蟲病診斷方法包括病原學診斷、免疫學診斷和核酸診斷，另外還有超聲診斷技術，條形碼技術診斷等方法診斷血吸蟲病[3]。現有研究表明核酸診斷對發現血吸蟲早期感染有較明顯優勢，本文就核酸診斷的方法進展作一綜述。

1聚合酶鏈式反應法

PCR采用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以脫氧核苷酸為底物合成DNA。到如今PCR已發展到第三代技術。在常規PCR的基礎上，演變出了熒光定量PCR、巢式PCR等一系列PCR技術。

1.1常規PCR法常規PCR法是提取患者的糞便、尿液與血液中的血吸蟲DNA為模板用于PCR檢測的一種核酸檢測方法。有研究表明，在最初的感染后4周，在宿主體內血清中的日本血吸蟲DNA主要來自于死亡的血吸蟲蚴體和血吸蟲在生長過程中的外皮脫落物。這就為血吸蟲的早期檢測核酸引物設計奠定了基礎[4]。陸正賢等[5]探索了PCR檢測法在日本血吸蟲感染早期檢測的特異性和敏感性。最終能在早期感染后1周在日本血吸蟲的成蟲、蟲卵、日本血吸蟲感染家兔的肝組織、糞便和外周血清中均擴增到相對分子質量為230 bp的特異性陽性條帶，比糞檢法和免疫學方法早3～6周。該方法首創在感染第1周即能擴增出特異性DNA陽性條帶，且從日本血吸蟲感染宿主血清中檢測出特異性DNA。說明PCR檢測法具有一定的療效考核價值。Lodh等[6]用濾紙過濾尿液沉降物，提取其中物種專一性的重復片段，使用曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲的特異引物PCR擴增，相比糞檢蟲卵法，PCR擴增特異性引物有著更高的敏感性和特異性。此種方法有著更高的敏感性和特異性，可以檢測糞檢法和血尿癥未檢測出來的患者。此外，此種方法可使用單個尿液標本單個或同時檢測出曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲。

1.2熒光定量PCR熒光定量PCR(FQ-PCR)是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。秦圓方[7]在國內首次建立了SYBR GREEN熒光定量糞檢PCR法，建立了糞樣蟲卵數與定量PCR結果的定量關系，可望以PCR法精確測定日本血吸蟲感染度。此方法具有靈敏度高、特異性強、可估計感染度等優點。18SrRNA是核糖體RNA中的一類，存在核糖體當中與其他核糖體RNA和核糖體蛋白構成核糖體參與蛋白質的翻譯，18SrRNA經研究具有很高的保守性，且在血吸蟲基因組中拷貝數相當大。周立等[8]根據日本血吸蟲18S小亞基單位核糖體核酸(18SrRNA)基因設計特異性引物進行PCR擴增檢測克隆后的日本血吸蟲18SrRNA基因。最終重復性試驗表明穩定性好，整個實驗可在3 h內完成對樣品的檢測，用時短，最低能夠檢測出6.15 pg的血吸蟲18SrRNA，靈敏度高。王本敬[9]通過比較4種基因：pSjrh1.0、18SrRNA、SjR2的G55A克隆在基因組中的豐度，初步確定SYBR Green I熒光實時定量PCR(RQ-PCR)方法檢測日本血吸蟲的較適宜靶基因和反應條件。結論表明RQ-PCR具有較高的準確性、特異性。官威[10]建立了一種靈敏，高效的日本血吸蟲Taqman real-time PCR定量檢測法，選取日本血吸蟲高度重復基因SjR2為靶序列設計引物和Taqman探針，和曼氏血吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲、肺吸蟲均無交叉反應，檢測日本血吸蟲SjR2基因重組質粒梯度最小濃度為4.47×10 copies/μL，表明熒光定量PCR檢測法敏感度高、特異性強，具有潛在的應用價值。

1.3巢式PCR巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物，結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。劉愛平等[11]通過優化巢式PCR反應體系，在低存活量的成蟲感染家兔血清中3 d即可擴增到特異性目的條帶，檢出血吸蟲成蟲，具有很高的敏感性。Guo[12]篩選出了一段相對分子質量為303 bp的序列作為DNA檢測的靶序列，能夠快速在感染血吸蟲的家兔血清中擴增到目的片段。童群波等[13]選取日本血吸蟲高拷貝420 bp的Sjα1基因片段，設計了2對巢式引物擴增該基因片段，2周即能從血清和全血樣本中檢出特異性DNA。

2LAMP法

環介導等溫擴增技術(LAMP)于2000年由日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上首次公開發表。其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65 ℃恒溫擴增，15～60 min左右即可實現109～1010倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強、產物易檢測等特點[14]。

許靜[15]在參考陸正賢已建立的常規PCR法檢測血吸蟲病的基礎上，建立了LAMP法，LAMP法的靈敏性和特異性均高于PCR法，且敏感性顯著高于PCR法，約為PCR法的104倍。在療效考核的實驗中，LAMP法較PCR法晚一周轉陰，即第13周時轉為陰性，顯示出其具有更高的敏感性。曹仁祺[16]建立了糞便中血吸蟲蟲卵的LAMP檢測方法和PCR檢測方法，選取日本血吸蟲基因組中高度保守的多拷貝重復序列rbp基因為靶序列進行LAMP引物設計。不僅顯示出較PCR更高的敏感性，且對牛常見的病原體也有較好的特異性。王岑[17]選取了4種日本血吸蟲基因組重復序列作為擴增片段，并且篩選出一組特異性強、敏感性高的引物，優化反應體系和反應條件，建立了一種檢測全血的簡便、快速和高敏感性LAMP方法。

3基因芯片檢測

基因芯片檢測是一塊帶有DNA微陣列的特殊玻璃片或硅芯片片，在數平方厘米之面積上布放數千或數萬個核酸探針；檢體中的DNA、cDNA、RNA等與探針結合后，借由熒光或電流等方式偵測。經由一次測驗，即可提供大量基因序列相關信息。它是基因組學和遺傳學研究的工具。

周鈞等[18]運用基因芯片技術與曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲及其他所有基因進行BLAST，均無同源性。基因芯片可一次性大規模檢測日本血吸蟲，尤其適用于血吸蟲病流行區現場的檢測及監測，該方法解決了操作效率低和結果客觀性差等問題，具有快速、靈敏、特異性等優勢，可獲得準確、可靠的日本血吸蟲病流行病學資料，為及時地報告疫情，有效遏止疫情提供保障[19]。

基因芯片作為一種先進的、大規模、高通量檢測技術，應用于疾病的診斷，研究人員應用基因芯片就可以在同一時間定量地分析大量(成千上萬個)的基因表達，具有信息量大、快速、可進行高通量篩選以及數據一致性好等優勢[20]。有相關報道利用基因芯片技術分析曼氏血吸蟲不同性別成蟲接觸后誘導的基因表達情況[21]。也有報道利用基因芯片技術分析日本血吸蟲尾蚴階段高表達的基因[22]。通過侵入，尾蚴將經歷巨大的變化，并且釋放分泌產物以適應新環境并且逃避宿主的免疫攻擊，利用基因芯片技術分析日本血吸蟲在尾蚴階段高表達的基因對研究血吸蟲的檢測也具有深遠意義。

4小結

血吸蟲病仍然是我國流行病防治重點工作之一，根據2012年全國血吸蟲病疫情通報，截至2012年底，全國仍至少有24萬血吸蟲患者[23]，我國日本血吸蟲病流行形勢仍然嚴峻。能夠在疫區建立快速準確診斷血吸蟲病的方法是一種發展趨勢，而核酸檢測因其高敏感性、高特異性逐漸成為檢測血吸蟲病方法的熱門研究方向。同時，根據生物信息學方法、基因比對方法等，針對不同靶序列片段的核酸診斷方法也在進一步研究，但目前為止尚未見到用于血吸蟲病流行疫區現場的核酸診斷報道。推測其原因可能有：(1)DNA的在標本的提取過程中會有損失，無論是通過糞便或是血清提取血吸蟲DNA，因其復雜的提取過程、提取方法、提取試劑盒的不同，都會對血吸蟲基因組DNA造成一定的損失，而多拷貝的靶基因能夠在一定程度上彌補DNA提取有損失的缺陷。(2)通常在實驗室的研究方法是建立實驗動物模型，實驗動物模型中很多因素可人為控制，如選擇相同大小天數的家兔、感染相同數量的血吸蟲等，而疫區患者具有個體的差異性、自身的復雜性和感染病原體的多樣性。綜合上述情況對現場核酸檢測均會造成一定影響。(3)實驗條件和實驗操作限制了現場核酸檢測，大部分的核酸檢測都需要運用PCR儀等，而LAMP技術對實驗環境要求極高，這些客觀條件都會對現場核酸檢測造成一定的限制和影響。(4)用于擴增靶序列的基因種類有限，目前研究較多用于擴增靶序列的基因主要有來源于曼氏血吸蟲的121 bp高度重復序列、18SrRNA基因、逆轉錄子SjR2、Sjrh1.0、線粒體DNA等，這些靶序列的特異性和敏感性在面臨現場核酸檢測時仍不夠理想。

理想的診斷檢測方法應具備準確度高、敏感度高、易于操作、價格低廉，盡量無創等特點。對于一些診斷來說，早期診斷和治療在阻止長期并發癥或者阻斷致病因子的傳播方面發揮著重要作用[24]。Zhou等[25]根據日本血吸蟲18S小亞基單位核糖體核酸(18SrRNA)基因設計特異性引物進行熒光定量PCR擴增檢測克隆后的日本血吸蟲18SrRNA基因，可以檢測到10 fg的日本血吸蟲，比傳統的PCR檢測靈敏100倍。同時，也能夠在感染后1周的小鼠血清中檢測到日本血吸蟲，在感染后4周的小鼠排泄物中檢測到日本血吸蟲，比鏡檢糞便中的蟲卵早了一個星期。LAMP雖然靈敏度也較高，反應時間短，但LAMP方法對實驗環境要求太高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，假陽性問題比較嚴重。且相比熒光定量PCR方法，LAMP不能定量。熒光定量PCR相較傳統PCR特異性更強，通過引物和探針設計的“雙保險”，能夠避免檢測的假陽性。且靈敏度更高，分析PCR產物的對數期，通過自動化儀器收集的熒光信號，避免了人為因素干擾,且熒光定量PCR不需要對擴增產物進行后續實驗分析，操作簡單。而巢式PCR相較于熒光定量PCR的靈敏度也較低。目前核酸檢測技術中易于操作這一項仍有很大的提升空間，而準確度和敏感度的提高，隨著技術和研究的不斷發展，可以用生物信息學尋找特異性和敏感性更高的靶序列。隨著對實驗環境和條件的降低，實驗操作步驟的簡化，血吸蟲核酸檢測的成本也能隨即下降。在無創方面，可以多開發針對糞便的檢測方法，而唾液、尿液也可以選作檢測樣本進行開發研究，以簡化取樣，減少患者取樣這一過程帶來的創傷。

參考文獻

[1]Gryseels B,Polman K,Clerinx J,et al.Human schistosomiasis[J].Lancet,2006,368(11):1106-1118.

[2]周立.血吸蟲病早期診斷方法和白介素22轉基因小鼠模型的建立 [D].武漢：武漢大學，2011.

[3]周帥鋒，余路新，汪世平.血吸蟲病的診斷檢測技術及研究進展 [J].熱帶醫學雜志，2009,9(3):335-346.

[4]Jing X,Ai PL,Jun JG,et al.The sources and metabolic dynamics of Schistosoma japonicum DNA in serum of the host.[J].Parasitol Res,2013,112(1):129-133.

[5]陸正賢.聚合酶鏈反應在日本血吸蟲病家兔感染早期檢測及療效考核中的應用研究 [D].蘇州：蘇州大學，2007.

[6]Lodh N,Naples JM,Bosompem KM,et al.Detection of parasite-specific DNA in urine sediment obtained by filtration differentiates between single and mixed infections of schistosoma mansoni and S.haematobium from Endemic Areas in Ghana[J].PLoS One,2014,9(3):312-314.

[7]秦圓方.PCR技術用于日本血吸蟲感染檢測研究 [D].南京：南京醫科大學，2009.

[8]周立，梁冰，趙友云，黃露，王業富.實時熒光定量PCR法檢測日本血吸蟲 [J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2008,26(4):299-301.

[9]王本敬、Real-time PCR檢測水體日本血吸蟲尾蚴和小鼠感染早期檢測的研究 [D].蘇州：蘇州大學，2011.

[10]官威、Real-time PCR檢測感染宿主血清日本血吸蟲DNA水平動態變化及其在血吸蟲病診斷和療效考核中的意義 [D].蘇州：蘇州大學，2013.

[11]劉愛平，楊巧林，郭俊杰，等.巢式PCR法檢測日本血吸蟲低感染度宿主血清DNA的研究 [J].蘇州大學學報：醫學版，2010,30(5):915-917.

[12]Guo JJ,Zheng HJ,Xu J,et al.Sensitive and specific target sequences selected from retrotransposons of Schistosoma japonicum for the diagnosis of schistosomiasis[J].PLoS Negl Trop Dis，2012，6(3):e1579.

[13]童群波，陸紹紅，汪天平，等.巢式PCR檢測日本血吸蟲感染的研究[J].寄生蟲與醫學昆蟲學報，2009,16(4):203-205.

[14]李秉鴻.實時熒光定量檢測技術及應用[J].動物醫學進展，2003,28(1):4-6.

[15]許靜.核酸檢測技術在日本血吸蟲感染宿主早期診斷及療效考核中的應用研究 [D].蘇州：蘇州大學，2008.

[16]曹仁祺.日本血吸蟲病環介導等溫擴增診斷方法的建立和初步應用 [D].武漢：華中農業大學，2010.

[17]王岑.環介導同溫擴增檢測全血日本血吸蟲DNA的研究 [D].南京：南京醫科大學，2011.

[18]周鈞，錢萬紅，李越希，等.日本血吸蟲檢測基因芯片的研制及初步應用[J].江蘇醫藥雜志，2004,30(6):455-456,483.

[19]周鈞，陶開華，李越希，施正良，等.基因芯片檢測日本血吸蟲及其現場應用[J].醫學動物防治，2003,19(5):524-527.

[20]Chang L,Zhong S,Zhao N,et al．Application of genetic deafness gene chip for detection of gene mutation of deafness in pregnant women.[J].J Otology，2014，9(2):347-381．

[21] Waisberg M,Lobo FP,Cerqueira GC,et al.Microarry analysis of gene expression induced by sexual contact in Schistosoma mansoni.[J].BMC Genomics,2007,20(8):812-814.

[22]Hu S,Law PK,Fung MC,et al.Microarray analysis of genes highly expressed in cercarial stage of Schistosoma japonicum and the characterization of the antigen Sj20H8.[J].Acta Trop,2009,112(1):26-32.

[23]李石柱，鄭浩，高婧，等.2012年全國血吸蟲病疫情通報 [J].中國血吸蟲病防治雜志，2013,25(6):557-562.

[24]The TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel.Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases:general principles.

[25]Zhou L,Tang J,Zhao Y,et al.A highly sensitive TaqMan real-time PCR assay for early detection of Schistosoma species[J].Acta Trop，2011,120(1/2)：88-94.

(收稿日期：2015-07-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.032

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)01-0074-03

*基金項目：湖北省自然科學基金項目(2013CFB461)。

作者簡介：孫莉軍，女，湖北省臨床檢驗中心主任醫師，主要從事臨床微生物學檢驗質量管理和臨床實驗室管理研究。△通訊作者，E-mail：wangyefu@whu.edu.cn。