卵巢功能早衰致不孕癥的治療現狀及進展

吳云青，宋丹，李紅

卵巢功能早衰致不孕癥的治療現狀及進展

吳云青，宋丹，李紅△

卵巢功能早衰（POF）是指女性在40歲之前發生閉經，以高卵泡刺激素及低雌激素水平為特征，對年輕女性內分泌功能、生育能力及心理造成了嚴重影響。近年來，POF在女性不孕患者中的比例呈上升趨勢。目前，POF所致閉經及低雌激素狀態可通過激素替代治療（HRT）得到改善，而POF所致不孕癥的治療仍處于探索階段，包括促排卵、供卵、卵子冷凍技術、基因治療、干細胞治療以及體外激活（IVA）剩余的休眠卵泡等。近年來，基因及干細胞治療在動物實驗中取得了一定進展，為POF患者生育能力的恢復帶來了希望；IVA是POF不孕治療的新探索，可能讓一些POF患者擁有攜帶自身基因的后代，盡管成功率較低，但已有成功的案例報道。對POF所致不孕癥的治療現狀及研究進展進行綜述。

卵巢功能早衰；不育，女（雌）性；基因療法；干細胞；體外激活

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：498-501）

卵巢功能早衰（premature ovarian failure，POF）是指40歲之前由于各種原因導致卵泡發育破壞或耗竭而發生卵巢功能衰竭，以閉經、高促性腺激素（Gn）和低雌激素水平為特征的疾病。由于POF患者在年輕時就發生自發性排卵停止和雌孕激素降低，POF治療大多是采取激素替代治療（HRT）；該方案可以補充患者雌孕激素，但對POF所致不孕癥基本沒有治療作用。有數據表明，青春期和育齡女性癌癥患者在進行放療、化療之前自愿選擇生育力保存，即冷凍保存其卵巢組織、成熟卵母細胞或胚胎，是目前比較可行的方法[1]。對POF患者來說，目前的不孕癥治療方法大多數是通過使用年輕婦女捐贈的卵子進行體外受精和胚胎移植[2]。基因治療及干細胞治療有望在不久的將來開展POF不孕治療的臨床試驗，但目前尚處于動物實驗階段。盡管POF患者卵巢中仍有較多剩余的休眠卵泡，但這些卵泡很難自發生長，因此這些患者利用自身卵子妊娠的希望渺茫。針對這種情況，體外激活（in-vitro activation，IVA）技術可通過人工激活殘留的休眠卵泡使POF患者用自身的卵子獲得妊娠，盡管成功率較低，但已有成功的案例報道。現就POF所致不孕癥的治療現狀及研究進展進行綜述。

1　POF所致不孕癥的治療現狀

1.1促排卵治療Bidet等[3]研究表明，在358例特發性POF患者中，24%的患者可以間歇性地自發恢復卵巢功能，其中4.4%患者自然妊娠。因此早期發現POF患者并積極促排卵治療，仍然有機會獲得妊娠。臨床研究發現，對POF患者單純使用氯米芬（CC）促排卵治療無成熟卵泡發育，改用人絕經期促性腺激素（HMG）/人絨毛膜促性腺激素（hCG）方案或促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）/HMG/hCG方案促排卵治療后有成熟卵泡生長，且有臨床妊娠的案例。有證據表明，對于POF患者，在使用外源性Gn促排卵前，預先行雌二醇（E2）降調，能有效降低POF患者體內卵泡刺激素（FSH）水平，從而提高排卵率[4]。有報道稱脫氫表雄酮（DHEA）能改善POF患者的妊娠結局[5]。DHEA能提高卵母細胞及胚胎的質量，增加獲卵數目，提高臨床妊娠率，降低流產率，這提示DHEA可提高卵巢儲備功能[6]。目前全球約有1/3的生殖醫學中心已將DHEA運用于臨床。但由于有些POF患者卵巢內卵泡儲備較低，促排卵治療往往無效。

1.2捐贈供卵1984年Lutjen等[7]首次通過供卵與HRT幫助POF患者成功妊娠，為POF患者實現了生育的可能。Naredi等[8]研究顯示，在POF患者進行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）前進行HRT，有助于改善子宮內環境，增加子宮內膜厚度，可顯著提高妊娠率。對大多數有生育要求的POF患者來說，卵子捐贈是獲得妊娠的首選方案，每個周期約有40%～50%的成功率。但有研究發現，卵子捐贈后妊娠較常規IVFET后妊娠的產科及新生兒并發癥發生率偏高，如妊娠期高血壓、子癇前期、低出生體質量、早產、剖宮產等[9]。盡管供卵及IVF-ET對于POF患者或其他遺傳因素所致自身卵子不能使用的患者是一個很好的選擇，但仍面臨供者不足的難題；此外，有關胚胎和卵子捐贈的法律和倫理問題仍存在爭議，從而使得卵子的獲取存在很大難度。

1.3自身卵子冷凍技術1986年首次將冷凍卵子復蘇后進行IVF-ET，并成功妊娠[10]，使得冷凍卵子技術在輔助生殖領域得到了廣泛應用。卵子冷凍技術通常應用于POF，因將接受腫瘤放、化療而避免卵巢功能損傷，希望延遲生育年齡，以及建立卵子庫等[11]。冷凍卵子的最初方法是程序化慢速冷凍法，雖然可獲得較好的冷凍效果，卻無法避免細胞形成冰晶而造成的損傷[12]。隨后興起的玻璃化冷凍能很好地解決慢速冷凍法無法克服的冰晶損傷問題，更適應實驗室的常規，且操作簡易，冷凍迅速，不需要昂貴的儀器，是目前卵子冷凍的首選方法[13]。有研究顯示，采用玻璃化冷凍的卵子解凍后在發育潛能、優質胚胎率、移植率、妊娠率以及多胎妊娠率方面與新鮮卵子無顯著差異[14-15]。盡管現有的卵子/卵巢組織冷凍技術尚未達到理想的臨床效果，但隨著冷凍方案的不斷改進，冷凍技術必將造福于廣大患者。

1.4基因治療基因治療是指將外源性正常基因序列導入靶組織或細胞中，通過糾正或補償異常基因或缺陷基因，從而達到治療相關疾病的目的。卵巢的發育、卵泡的生長涉及許多的基因與分子，其中任意基因發生突變均可能導致卵泡發育破壞或耗竭。有研究顯示，FSH受體（FSHR）基因多態性與POF的發生密切相關[16]，在有FSHR缺陷的小鼠中，因卵泡在早期發生閉鎖導致體內FSH水平升高和E2水平降低，從而發生類似于POF的表現。Ghadami等[17]將攜帶有正常FSHR基因的腺病毒載體注射至FSHR缺陷的小鼠卵巢內，發現小鼠外周血中E2水平上升2～3倍，FSH下降約50%，且在卵巢內檢測到FSHR mRNA，提示FSHR基因可促進卵泡發育，恢復POF小鼠雌激素分泌，對POF具有治療作用。當然，還有一些基因如骨形態發生蛋白15（BMP15）及雌激素受體1（ESR1）等與POF的發生有關[18]，也可作為POF治療的候選基因。遺傳因素是POF發生的一個重要原因，但涉及相關的基因比較多，不能用單一的基因突變解釋。目前所說的基因治療，僅停留在動物實驗研究階段。真正運用于臨床還需解決許多問題，如尚未完全找到與POF發病相關的基因，基因載體的安全性及有效性問題，缺乏基因定向導入靶組織的技術，基因轉移的倫理道德問題等。隨著分子生物學的發展與研究的不斷深入，相信一定能克服以上問題，找到與POF發病相關的基因，發現其相關的作用機制并進行進一步的基因靶向性治療，從而發現治療POF的新方法。

1.5干細胞治療干細胞是一類具有無限增殖、多向分化潛能、自我更新、復制等特點的早期未分化細胞，可分為成體干細胞和胚胎干細胞。胚胎干細胞因其倫理爭議大，在臨床應用上受到限制。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因獲取相對容易，倫理學爭議小，近年來逐漸成為臨床研究的熱點。在POF的動物模型研究中發現MSCs能有效恢復卵巢功能及減少顆粒細胞的凋亡，為POF患者的治療帶來了新的希望[19]。Huang等[20]研究發現，人類臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）在體外培養下可分化為生殖細胞。Song等[21]將UCMSCs經尾靜脈移植入經環磷酰胺誘導的POF大鼠體內，發現其可遷移至卵巢并存活生長，該研究提示UCMSCs能有效降低體內FSH水平，升高抗苗勒管激素（AMH）及E2水平，且能促進次級卵泡生長、減少卵巢細胞凋亡，說明UCMSCs對卵巢損傷有一定的修復作用。目前干細胞治療真正運用于臨床僅限于少數疾病，如惡性血液病等，其治療POF仍處于動物實驗研究階段，對其修復卵巢損傷的機制需進一步研究證實。隨著研究的不斷深入，相信不久的將來，干細胞治療將廣泛應用于臨床，這將為POF患者帶來希望。

2　POF所致不孕癥治療的最新研究進展——IVA

2010年Li等[22]報道了一種新的治療POF所致不孕癥的方法——IVA，通過激活體內剩余的休眠卵泡可以讓POF患者用自己的卵子妊娠。

2.1休眠始基卵泡的激活在卵巢中始基卵泡處于休眠狀態，一些卵巢內因子包括kit配體、血管內皮生長因子、白血病抑制因子等被證實對激活休眠狀態的始基卵泡起重要作用[23]。動物實驗表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路與始基卵泡的激活密切相關。kit配體結合其同源酪氨酸激酶受體，可激活PI3K，繼而催化二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）生成三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[24]，PIP3可激活3磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）最終激活AKT。激活的AKT能使一系列下游靶蛋白發生磷酸化，包括控制蛋白生物合成及調節細胞生長的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、抗增殖及凋亡的FOXO3蛋白以及維持原始卵泡儲量的p27蛋白等。第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因（PTEN）通過將PIP3去磷酸化成PIP2，對PI3K-AKT信號通路起負反饋調節作用。在有FOXO3缺陷的小鼠中，原本處于休眠期的始基卵泡在新生小鼠階段就會自發地激活，導致卵泡過早的耗盡，類似于POF的表現。在成年小鼠卵母細胞中，PTEN的缺失可激活AKT發生磷酸化，最終導致始基卵泡的激活[25]。

2.2抑制Hippo信號通路可激活卵泡發育Hippo信號通路是調節細胞增殖和決定器官大小的重要細胞內信號系統[26]。Yes相關蛋白（YAP）和轉錄共激活因子（TAZ）是Hippo信號通路下游最主要的效應器，它們作為轉錄共激活因子及多功能細胞內連接蛋白，參與細胞內信號的轉導和對其下游靶因子的轉錄共激活過程。YAP蛋白聯合TEA結構域（TEAD）轉錄因子，可上調CCN生長因子和BIRC（baculoviral inhibitors of apoptosis repeat containing）凋亡抑制因子，CCN和BIRC因子轉而刺激細胞生長和增殖[27]。Hippo信號可使關鍵轉錄激活因子（YAP和TAZ）磷酸化而失活。因此，破壞Hippo信號可減少YAP蛋白磷酸化，使YAP在細胞核內的水平增加，從而促進細胞的增殖。f-肌動蛋白形成的應力纖維被證實可以破壞Hippo信號最終導致細胞核內YAP積聚[28]。有研究證明卵巢碎片可使球狀肌動蛋白聚合成f-肌動蛋白短暫增加，繼而減少YAP蛋白磷酸化，最終導致下游CCN生長因子和BIRC凋亡抑制因子的上調[29]。在人類中，將卵巢皮質帶切成小碎片后增加了CCN生長因子在卵巢皮質中的表達[29]。

2.3IVA及IVF-ET的運用盡管各種激素療法及促排卵方法已經被廣泛應用于POF治療，但這些治療方法的成功率仍然很低。能使POF患者利用自身卵子妊娠的治療方法令人期待。PI3K激活劑通過激活PI3K-AKT信號通路來激活小鼠或人類的休眠始基卵泡[29-30]。卵巢碎片通過誘導Hippo信號通路的破壞從而促進了次級卵泡的生長[29]，這也是IVA方法的理論基礎。該方法主要通過結合卵巢碎片及PI3K激活劑來激活POF患者卵巢中剩余的卵泡。為了確認POF患者卵巢皮質中的剩余卵泡，可從每個皮質帶切出10%～20%的皮質，在冷凍前進行組織學分析，其能有效預測IVA治療能否成功促進卵泡發育[31]。將一側或雙側卵巢組織通過腹腔鏡手術取出，然后切成小碎片，可通過玻璃化技術將其冷凍[31]，需要使用時再解凍并將這些卵巢小塊在含有PI3K激活劑的器皿中體外培養2 d[29]，然后在腹腔鏡下將這些卵巢小塊移植至輸卵管漿膜下。在卵巢小塊自體移植后，通過每周或每2周檢測血清雌激素、Gn水平及陰道B超探測生長中的竇卵泡來監測卵泡生長。在外源性Gn刺激前，通過雌激素及GnRHa預處理，可抑制內源性Gn的升高[29]，從而恢復剩余卵泡對外源性Gn刺激的反應性，并可抑制卵泡生長過程中過早黃素化。運用以上方法，經IVF-ET后，有研究報道3例成功妊娠，盡管其中1例流產，但另外2例IVA嬰兒已健康出生[30]。

3　結語

目前POF的病因與發病機制尚未完全闡明，其誘發因素較多，如何幫助POF患者獲得妊娠一直是生殖醫學的難點。基于對POF病因和機制的研究，探索POF不孕的治療方法，如對于尚存在竇前卵泡的POF患者可給予短期促排卵治療，某些患者仍可自然受孕；而對于短期內無生育要求的POF患者，可采用卵子冷凍技術；基因治療可用于遺傳因素所致的POF患者，但目前POF的遺傳因素涉及的相關基因較多，不能用單一的基因突變解釋，基因治療也僅停留在動物實驗研究階段；對于免疫損傷或放化療所致的POF，可考慮干細胞治療，但其恢復卵巢功能的機制需進一步研究證實，其治療后的長期作用也需進一步驗證。胚胎干細胞因其倫理爭議大，在臨床應用中受到較大限制。IVA是治療POF不孕的新探索，可能讓一些POF患者擁有攜帶自身基因的后代，盡管成功率較低，但已有成功案例報道。IVA有增加不孕癥患者成熟卵子數量的潛力，但其不能改善與年齡相關的卵子質量的衰退。當前，POF不孕的干細胞治療、基因治療、IVA治療是研究的熱點，有望在不久的將來開展有限規模的小樣本的臨床試驗。

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[本文編輯王昕]

Progress in Treatment of Infertility Related to Premature Ovarian Failure

WU Yun-qing,SONG Dan,LI Hong.
Center for Reproduction and Genetics,Nanjing Medical University Affiliated Suzhou Hospital,Suzhou 215002,Jiangsu Province,China

LI Hong,E-mail:hongliszivf@163.com

Premature ovarian failure（POF）is diagnosed by amenorrhea,along with the elevated follicle stimulating hormone（FSH）and the decreased estrogen（E2）levels in women before 40 years old.POF has a severe impact on the endocrine function,fertility and mental state of those women.In recent years,the proportion of patients with POF in female infertility has a rising trend.The amenorrhea and low-estrogen level caused by POF can be improved by hormone replacement therapy（HRT）,while the treatment for infertility need more exploratory study and clinical practice,including ovulation induction,oocyte donation transplant,egg cryopreservation technology,as well as some new technologies such as gene therapy,stem cells therapy and in-vitro activation（IVA）.The gene therapy and the stem cells therapy have been made some progress in animal tests.These achievements bring POF patients a new hope in the recovery of fertility.IVA is a further exploration to activate the residual dormant follicles for those POF infertility women,although the success rate is not satisfactory.However,there have been some successful cases of IVA treatment.In this paper,the progress in the treatment of infertility related to POF was discussed.

Ovarian failure,premature;Infertility,female;Gene therapy;Stem cells;In-vitro activation

2014年度蘇州市臨床重點并中診療技術專項項目（LCZX201411）

215002南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心

李紅，E-mail：hongliszivf@163.com

△審校者

（2016-08-10）