腸道菌群調節免疫反應增強腫瘤治療效果

宗方方，　譚　俊，　邵　雷，　陳代杰*

1.上海師范大學 生命與環境科學學院，上海 200234； 2.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203

腸道菌群調節免疫反應增強腫瘤治療效果

宗方方1,2，譚俊2，邵雷2，陳代杰2*

1.上海師范大學 生命與環境科學學院，上海 200234； 2.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203

摘要：人體健康與腸道菌群息息相關，越來越多的研究顯示正常菌群不僅在消化、免疫等方面有諸多不可替代的作用，腸道菌群結構的改變與失衡更是與肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病密切相關。最新研究表明藥物刺激免疫系統引起的抗腫瘤免疫反應以及自身免疫反應都離不開腸道菌群的參與，腸道菌群能夠通過調節免疫反應增強腫瘤治療效果。

關鍵詞：腸道菌群； 人體健康； 免疫反應； 腫瘤治療

腸道菌群是一個獨特多樣的生態系統，其種類超過1000種，細胞總數高達1014，是已發現的生態系統中細胞密度較高的系統之一[1]。種類繁多的腸道菌群不僅能實現自身間物質及信息交換，且能與宿主細胞之間不斷地進行信息交流、參與宿主代謝、生理性地調控重要化學物質的轉化。腸道菌群在宿主體內扮演著非常重要的角色，越來越多的研究證實人體健康與腸道菌群息息相關，不僅在消化、免疫等方面有諸多不可替代的作用，更是與肥胖[2-4]、糖尿病[5-7]、心腦血管疾病[8，9]、艾滋病[10]、癌癥[11-13]等多種疾病密切相關。最新的研究表明：腸道菌群能夠通過調解腫瘤微環境中抗腫瘤相關免疫反應，從而增強抗癌藥物的治療效果[14-19]。

1腸道菌群增強小分子類藥物的腫瘤治療效果

1.1鉑類化合物

鉑類藥物是迄今為止應用最廣泛的抗腫瘤藥之一。自1979年第一個鉑類藥物順鉑問世以來，鉑類藥物為許多腫瘤的化療提供了有力的武器。由于順鉑的毒性及耐藥性，驅使一系列毒性或耐藥性更小的鉑類抗腫瘤藥在此基礎上產生，至今為止已有5種鉑類藥物成功上市，其中卡鉑和奧沙利鉑在全球廣泛應用，奈達鉑、洛鉑、庚鉑在亞洲部分地區得以上市應用。

Iida等人[14]研究證實腸道菌群可以增強鉑類等化療藥物對腫瘤的治療效果。Iida等人將小鼠的飲水中加入萬古霉素、亞胺培南和新霉素組成的抗生素混合物(ABX)，三周后向小鼠皮下注射EL4及MC38腫瘤細胞，當腫瘤直徑大于4毫米時采用鉑類藥物對小鼠進行化療。研究結果顯示奧沙利鉑可以根除荷瘤小鼠體內絕大多數皮下腫瘤，從而延長小鼠的存活時間，經過抗生素ABX處理后，明顯減慢了小鼠體內腫瘤的衰亡，降低了小鼠的存活率。經過抗生素ABX處理同樣也降低了順鉑對EL4腫瘤細胞的治療效果。GF小鼠(無菌小鼠)實驗也證實缺少腸道菌群會降低鉑類化合物對腫瘤治療的效果。Iida等人[14]通過基因表達分析發現，鉑類化合物的抗腫瘤作用并不依賴腫瘤壞死因子，而是通過產生活性氧簇(ROS)從而引起DNA損傷及細胞凋亡。在經ABX處理小鼠或GF小鼠中，腸道菌群的缺失引起ROS產生減少及細胞毒性的降低，導致鉑類化合物對腫瘤細胞治療效果減弱。

1.2環磷酰胺

環磷酰胺(CTX)是一種有效的烷基化抗腫瘤藥物，是目前臨床上重要的抗腫瘤藥物之一。它能夠誘導免疫原性腫瘤細胞死亡，破壞免疫抑制性T細胞，協助Th1和Th17細胞控制腫瘤細胞增殖。

Viand S等人[15]通過小鼠模型研究發現，環磷酰胺能夠激發小腸內某些特定的革蘭氏陽性菌遷移，從而引起小腸菌群的顯著改變。Sophie Viaud等人通過高通量焦磷酸測序和QPCR分析了腸道菌群的整體組成，發現經過環磷酰胺治療后的荷瘤小鼠小腸內細菌總數及柔嫩梭菌的數目都沒有改變，但會導致約氏乳桿菌、鼠乳桿菌、海氏腸球菌等減少，并向二級淋巴器官發生選擇性遷移。同時通過流式細胞儀組織分離和原位免疫熒光染色發現，服用環磷酰胺后引起菌群失調的同時，小腸固有層中CD103+CD11b+樹突細胞及αβ(TCRαβ)+CD3+T細胞分泌轉錄因子RORγ t的能力明顯減弱。環磷酰胺治療后的SPF小鼠(無特定病原體小鼠)脾細胞體外釋放IL-17(白介素-17)增加，而在GF小鼠中未能得到此結果。研究顯示在使用廣譜抗生素(粘菌素、氨芐西林、鏈霉素等聯合用藥)處理腸道后，也抑制了脾細胞對IL-17和IFNγ的環磷酰胺刺激性分泌。用萬古霉素和革蘭氏陽性菌特異性抗生素治療小鼠同樣減少了環磷酰胺誘導型TH17細胞的轉化。Sophie Viaud等人進一步研究發現在二級淋巴器官中，這些腸道細菌能夠刺激“病原性”輔助T細胞17(pTH17)和TH1記憶細胞產生免疫反應，而荷瘤無菌小鼠或經抗生素作用殺死革蘭氏陽性菌的荷瘤小鼠的pTH17細胞特異性免疫反應明顯減弱，且腫瘤細胞對環磷酰胺表現出耐受。然而，通過pTH17細胞轉移之后又部分恢復了無菌小鼠及抗生素處理小鼠體內環磷酰胺的抗腫瘤作用[16]。這些結果表明腸道微生物能夠調節環磷酰胺引發的宿主免疫反應，從而增強環磷酰胺抗腫瘤治療效果。

1.3CpG寡核苷酸

免疫系統通過高度保守的受體識別病原體，從而激活機體的固有免疫以及獲得性免疫應答。Toll樣受體(TLR)是目前研究最清楚的受體之一，共有10個分子家族。CpG寡核苷酸(CpG-ODN)是TLR9受體激動劑，能夠直接誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的活化和成熟，促進Th1型細胞因子的分泌及抗原提呈細胞(APC)的成熟和活化，具有激活機體免疫系統的作用。

Iida等人[14]向荷瘤小鼠體內連續三周給藥ABX，當腫瘤直徑大于4毫米時對小鼠進行CpG-ODN免疫治療。腫瘤基因表達分析結果顯示經抗生素處理，小鼠體內與炎癥反應、吞噬作用、抗原提呈及適應性免疫反應有關的基因下調，而與組織發育、惡性腫瘤和新陳代謝相關的基因上調。抗生素作用顯著破壞了小鼠腫瘤細胞中CpG-ODN誘導型Tnf的表達及白細胞產生的頻率，同時降低了某些免疫細胞中細胞因子的數量及腫瘤相關樹突細胞中CD86的表達及IL-12B的產生。為了確定ABX的作用效果是否與減少細菌負荷量有關，Iida等人隨后采用GF荷瘤小鼠及SPF荷瘤小鼠分別接受CpG-ODN治療。結果表明GF小鼠對CpG-ODN的治療反應明顯減弱，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-12B的產生量顯著降低。進一步研究發現灌胃給藥細菌脂多糖(LPS)可以很大程度上修復ABX處理后野生型小鼠腫瘤細胞中的Tnf的表達及白細胞產生的頻率，但是在Tlr4缺失型小鼠中未產生這種效果，Tlr4缺失反而會導致免疫治療后Tnf感應減弱及腫瘤細胞退化降低[14]。這些研究結果表明，細菌產物(如LPS)經過TLR4活化后直接或間接誘導腫瘤相關骨髓細胞對CpG-ODN的免疫應答，腸道菌群數量的減少影響CpG-ODN抗腫瘤免疫反應的發生，導致CpG-ODN腫瘤治療效果減弱。

2腸道菌群增強檢測點抑制劑及抗體類藥物的腫瘤治療效果

2.1CTLA-4檢測點抑制劑

CTLA-4(即細胞毒性T細胞相關蛋白-4)是一種T淋巴細胞負調節器，影響人體的免疫系統，削弱其殺死癌細胞的能力，是目前研究最熱的癌癥免疫治療靶點[16]。美國FDA于2011年批準免疫檢查點抑制劑Ipilimumab上市，用于治療晚期黑色素瘤。Ipilimumab能與CTLA-4結合并有效阻滯CTLA-4與其配體CD80/CD86的相互作用，增加T細胞的活化和增殖。然而一些臨床結果表明僅有20%的黑色素瘤患者經過Ipilimumab治療后獲得了壽命的延長。

Zitvogel[17]認為Ipilimumab能夠引發潰瘍并引起腸道內一部分細菌的死亡，這一副作用暗示Ipilimumab的藥效可能與腸道微生物有很大關系，腸道內某一特定類型的細菌可能參與了微生物的抗腫瘤效應。為了驗證這一猜想，Zitvogel等人[17]通過小鼠黑色素瘤模型及MC38腫瘤模型研究發現抗CTLA-4抗體藥物能夠抑制SPF小鼠中腫瘤細胞的生長，而在GF小鼠中未表現這種作用。向小鼠給藥廣譜抗生素混合物(ACS，即氨芐西林、粘菌素、鏈霉素聯合用藥)及亞胺培南單獨用藥也會造成抗CTLA-4抗體藥物治療效果減弱。這些結果表明Ipilimumab等抗CTLA-4抗體藥物發揮抗癌作用需要腸道菌群的幫助。采用16S rRNA高通量基因測序分析發現，抗CTLA-4抗體藥物能夠引起腸道菌群的明顯改變，CTLA-4封鎖導致小鼠糞便中擬桿菌屬和伯克氏菌屬數量減少。采用QPCR對小腸粘膜及糞便中擬桿菌屬進行分析顯示接受抗CTLA-4抗體藥物后擬桿菌屬相對豐度呈減少趨勢，而小腸粘膜中某些特殊種屬，如多形擬桿菌及單行擬桿菌相對豐度提高。隨后Zitvogel等人將特定的微生物種群如多形擬桿菌、脆弱擬桿菌等定植到經ACS處理小鼠及GF小鼠腸道內部，結果顯示腸道菌群的再生能夠恢復抗CTLA-4抗體藥物的抗腫瘤效果。同樣，通過向抗CTLA-4抗體藥物治療的GF小鼠口服喂食脆弱擬桿菌可以提高其淋巴腫瘤細胞中Th1免疫應答，促進樹突細胞的成熟及分化。這些研究結果表明擬桿菌屬在調節CTLA-4檢測點抑制劑抗腫瘤免疫刺激中起到關鍵作用。

2.2抗PD-1/PD-L1抗體類藥物

腫瘤逃逸是目前腫瘤免疫治療公認的障礙，已有研究表明程序性死亡配體-1(PD-L1)與腫瘤的免疫逃逸機制有關。癌細胞能夠在自身表面產生PD-L1，與T細胞表面的細胞膜蛋白受體PD-1結合，PD-1/ PD-L1信號通路的激活可導致免疫抑制性腫瘤微環境形成，使腫瘤細胞逃避機體免疫監視和殺傷，從而促進腫瘤的發生與生長[18]。因此，采用抗PD-1/PD-L1抗體類藥物阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以逆轉腫瘤免疫微環境，增強內源性抗腫瘤免疫效應。

Sivan A等人[19]最新研究表明抗PD-L1抗體抗腫瘤作用存在個體差異可能與個體之間的腸道微生物組成存在差異密切相關。 Sivan A等人選用了分別來自Jackson實驗室(JAX)和Taconic農場(TAC)的攜有不同共生微生物群的同一品系小鼠，比較它們皮下黑色素瘤的增長。研究發現JAX小鼠體內黑色素瘤的生長速度明顯慢于TAC小鼠，而經過共同飼養后消除了兩種小鼠在腫瘤生長和免疫應答反應之間的差異，由此表明腸道微生物菌群差異能影響小鼠抗腫瘤免疫反應。且JAX小鼠體內自身特異性T細胞應答反應和瘤內CD8+T細胞積累明顯高于TAC小鼠，表明兩種小鼠抗腫瘤免疫反應之間的差異是由免疫系統介導的[19]。為了確定與增強抗腫瘤免疫反應有關的特定細菌，Sivan A等人考察了隨著時間的推移小鼠糞便中細菌含量，比較分析TAC小鼠和JAX小鼠257種菌群的相對豐度，雙歧桿菌是與腫瘤微環境中活性特異性抗原T細胞積累有明顯關聯的唯一關鍵菌群，經鑒定此類雙歧桿菌中主要是短雙歧桿菌、長雙歧桿菌和青春雙歧桿菌，且要達到抗腫瘤效果需要活細菌，因此事先服用熱失活的雙歧桿菌并不會增強腫瘤的治療效果。Sivan A等人[19]研究表明植入特定菌群與用抗PD-1/PD-L1抗體治療小鼠均可減緩腫瘤的生長，特定菌群與抗PD-1/PD-L1抗體聯合作用顯著增強了腫瘤治療效果。通過大規模測試發現雙歧桿菌能夠通過與漫游的樹突狀細胞相互作用觸發免疫反應，激活腫瘤殺傷性T細胞。這些研究表明抗PD-1/PD-L1抗體抗腫瘤作用存在個體差異，可能與個體之間的腸道微生物組成存在差異密切相關，雙歧桿菌能夠促進抗腫瘤免疫反應，增強抗PD-1/PD-L1抗體抗腫瘤作用。

3展望

人類腸道是一個巨大而又復雜的生態系統，在人類的生存中具有十分重要的作用。很早以前，人們就已經意識到了腸道內與人體共生的微生物對于人體健康具有極大的影響力。近年來腸道微生物與免疫系統之間的聯系引起了越來越多研究人員的密切關注,且越來越多的研究表明腸道菌群與抗腫瘤免疫反應息息相關。利用腸道微生物與免疫系統之間的聯系，通過選擇性調節腸道細菌來改善免疫療法將成為腫瘤治療的一條新途徑。

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Intestinal flora enhance tumor therapeutic effects by modulating immune responses

ZONG Fang-fang1,2, TAN Jun2, SHAO Lei2, CHEN Dai-jie2

1. College of Life and Environment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2. State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

AbstractHuman health is related to intestinal flora closely, more and more studies showed that the normal flora played an important role in terms of digestion, immunity, obesity, diabetes, cardiovascular disease, cancer and many other diseases. Recent studies showed that chemotherapy drugs stimulated antitumor immune responses and autoimmune responses required the participation of intestinal flora. The intestinal microbiota could affect the therapeutic effects by modulating the immune responses effects.

Key wordsintestinal microbiota; human health; immune responses; oncotherapy

基金項目：國家“重大新藥創制”科技重大專項(No.2013ZX09301302，No.2014ZX09507009-025)國家自然科學基金(No. 81573329)。

作者簡介：宗方方(1991～)，女，在讀碩士研究生。E-mail：elvazong@163.com。 *通訊作者：陳代杰，男，研究員。E-mail：hccb001@163.com。