發酵罐中利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水的研究

張　燕，　刁寧寧，　黃勛娟，　張建國,2*

1.上海理工大學 食品科學與工程研究所，上海 200093,2.工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)，天津 300457

發酵罐中利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水的研究

張燕1，刁寧寧1，黃勛娟1，張建國1,2*

1.上海理工大學 食品科學與工程研究所，上海 200093,2.工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)，天津 300457

摘要：利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水的優點是黑曲霉安全性好、菌絲球易收獲、利于降低成本且可以減少傳統處理方式所產生的污泥量。在前期研究的基礎之上，在攪拌式發酵罐中考察了黑曲霉菌絲球降低豆制品廢水化學需氧量(COD)的條件。研究結果表明，當豆制品廢水初始COD在2×103 mg/L，黑曲霉孢子濃度為1.44×103/L時，黑曲霉的菌絲能夠在攪拌式發酵罐中形成形態均一的菌絲球，同時可將廢水的COD降至842 mg/L，COD去除率達55.7%。該研究結果為在攪拌式發酵罐中利用黑曲霉菌絲球處理豆制品廢水提供了參考依據。

關鍵詞：豆制品廢水； 黑曲霉； 菌絲球； 化學需氧量

黑曲霉是一種菌絲體呈絨毛狀、網狀或絮狀的絲狀真菌，在工業上應用廣泛。美國食品藥品監督管理局(FDA)批準由黑曲霉生產的產物是食品級安全的產品(Generally Regard As Safe)[1]。黑曲霉被廣泛用于生產胞外酶和有機酸[2]，如葡糖淀粉酶、果膠酶和半乳糖苷酶等。在深層發酵過程中，黑曲霉形成菌絲球形態使檸檬酸產量提高[3]，控制菌絲形態能有效的控制黑曲霉的代謝產物[4]。黑曲霉還可用于污水處理[5]，能夠有效降解廢水中的有機物質，吸附色素并降低廢水的化學需氧量(COD)[6]。黑曲霉的菌絲球具有厭氧顆粒污泥和好氧顆粒污泥所不具備的諸多優點[7]，例如沉降速度快、易于固液分離、應用廣泛等。Silva等利用黑曲霉菌株AN400在間歇反應器中處理乳品廢水[8]。Hernandez等利用黑曲霉菌株UO-1處理不同淀粉濃度的啤酒和肉制品廢水[9]。

在工業發酵越來越流行的今天，發酵工程也越來越目標化、精細化、自動化[10]。這要求對發酵工藝的數學模型和優化技術進行研究，并考慮形態上培養液流變學和質量傳遞的影響，從而實現按比例放大發酵工藝，并建立完善的控制工藝參數[11, 12]。考慮到各種生物反應器的流動模式有所區別，可以假設，在實驗室規模的生物反應器中培養液能混合完全，而在用于工業生產的大規模生物反應器中則需一定混合時間才能達到95%的均一性[13]。培養液混合程度、葡萄糖、pH值和溫度梯度對發酵過程均有顯著影響[14, 15]。如果培養液混合程度過低，會影響培養基的氧含量，進而影響發酵[16]。本文對發酵罐中黑曲霉降低豆制品廢水COD的培養條件進行研究，確定黑曲霉形成菌絲球同時降低豆制品廢水COD的條件，為后續擴大培養規模奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1廢水、試劑和設備

豆制品廢水取自上海清美綠色食品有限公司。化學藥品購自國藥集團化學試劑有限公司。發酵罐(BLBIO-2L，2L)購自上海百倫生物科技有限公司。

1.1.2菌株與培養基

黑曲霉菌株(TCCC4002)取自工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基固體55，115 ℃滅菌20 min。察氏培養基(g/L)：無水葡萄糖2.5，NaNO33，K2HPO4·3H2O 1，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，pH 5.6，115 ℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1菌體保藏

用無菌蒸餾水洗下PDA培養基上的黑曲霉孢子，制備孢子懸浮液。將懸浮液與50%甘油按1∶1(v/v)混合均勻，分裝后置-70 ℃保存。每月重新活化后保存。

1.2.2黑曲霉菌絲球的制備

1.5 L豆制品廢水用NaOH溶液調pH至5.5后倒入發酵罐，115 ℃滅菌20 min。冷卻后接種。發酵罐轉速300 r/min，通氣量1 vvm，溫度30 ℃。考察孢子濃度對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響時，孢子接種濃度分別為3.52×104、1.41×104、3.52×103、7.04×102和70.4 /L。考察轉速的影響時，轉速梯度選取150 r/min、200 r/min、250 r/min、400 r/min，30 ℃，pH 4.5，通氣量1vvm，孢子濃度7.04×102/L。考察豆制品廢水濃度的影響時采用稀釋的方法，向不同稀釋倍數的廢水中添加營養元素(表1)，黑曲霉孢子濃度1.44×103/L。

表1　不同稀釋倍數豆制品廢水中營養

1.2.3孢子濃度對豆制品廢水處理的影響

發酵罐轉速200 r/min，初始pH 5.5，溫度30 ℃。豆制品廢水稀釋10倍后添加營養元素(見表1)。孢子濃度分別為1.44×107、1.44×106、1.44×105、7.20×104、1.44×103/L。其它條件同1.2.2。

2結果與分析

2.1孢子濃度對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響

黑曲霉孢子濃度對降低豆制品廢水COD的影響見圖1。從圖中可看出，培養72 h，當孢子濃度在70.4～3.52×104/L范圍內時，可不同程度的降低豆制品廢水的COD。五個批次(孢子濃度從高到低)的COD降低幅度分別為20.9%、20%、46%、32.9%、35.8%。孢子濃度為3.52×103/L時COD降低幅度最大。但五個批次的培養均未能形成均一的菌絲球。

圖1　孢子濃度對黑曲霉降低豆

2.2轉速對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響

分別采用轉速150 r/min、200 r/min、250 r/min和400 r/min進行培養，72 h后菌絲均呈無序狀。豆制品廢水COD降低幅度依次為3.2%、21.1%、16.6%、-2.2%。200 r/min～250 r/min之間黑曲霉生長狀況較好，廢水COD有較顯著的降低。當轉速為400 r/min時，COD沒有降低，這可能是因過高轉速影響了菌絲的生長(圖2)。

2.3稀釋倍數對黑曲霉在豆制品廢水中降低COD的影響

將豆制品廢水稀釋不同倍數后添加營養元素(硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、七水合硫酸鎂)至初始豆制品廢水中主要營養元素的濃度。黑曲霉孢子的接種濃度為1.44×103/L。培養72 h之后，稀釋2、5和10倍的豆制品廢水和原豆制品廢水的COD降低幅度分別為4.3%、22.8%、10.4%、24.2%。經過168 h培養后稀釋5、10倍的豆制品廢水COD分別為47.0%和37.3%。最終COD分別降低到842 mg/L和1.74×103mg/L(圖3)。觀察菌絲球的形態可以發現，稀釋倍數越大，菌絲球形態越均勻。提高稀釋倍數降低了培養液的粘度，改善了培養液的流動特性，因此可以形成更加均勻的菌絲球。

圖2　轉速對黑曲霉降低豆制品廢水COD的影響

圖3　稀釋倍數對黑曲霉在豆制品廢

2.4孢子濃度對稀釋后豆制品廢水COD的影響

將豆制品廢水稀釋10倍后添加營養元素(硝酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、七水合硫酸鎂)，調整pH至5.5。孢子濃度對稀釋后豆制品廢水COD的影響見圖4。從圖中可看出，廢水COD隨時間延長顯著降低。72 h培養后，按孢子濃度從高到低，廢水COD降低幅度分別為22.7%、19.1%、22.4%、22.5%、24.2%。孢子濃度為7.20×104/L時，經過144 h培養，COD降低至821 mg/L。孢子濃度為1.44×103/L時，經168 h的培養，COD降低至842 mg/L。菌絲球形態均勻，直徑沒有明顯變化。孢子濃度高于1.44×105/L時，孢子濃度越高形成的菌絲球越多，經過84 h培養后，菌絲球出現裂解、分散的現象。這可能是攪拌槳對菌絲球造成破壞的結果。圖5是稀釋10倍后豆制品黃降水中形成的黑曲霉菌絲球，以及經過處理后的豆制品廢水。從圖中可看出，菌絲球形態均一，易于收獲，經菌絲球處理后的豆制品廢水澄清。

圖4　孢子濃度對稀釋后豆制品廢水COD的影響

(a)

(b)　　　　　　(c)　　　　　　(d)

3結論

當前有關絲狀真菌菌絲球形態的研究報道較多，尤其是關于黑曲霉的菌絲形態[17]。黑曲霉可被用于發酵生產檸檬酸，不少學者關注400 μm直徑的黑曲霉菌絲球[18]，是因為黑曲霉生產檸檬酸時最佳形態是形成400 μm直徑的菌絲球，當直徑超過400 μm時會出現氧氣傳遞的限值[19]。絲狀真菌在搖瓶中形成較大菌絲球的現象比較普遍，但在發酵罐中形成菌絲球的報道較少，是目前研究的一個熱點。黑曲霉菌可以代謝豆制品廢水中的營養物質，且菌絲球體積較大、易于收獲，本研究利用黑曲霉菌來處理豆制品廢水，在發酵罐條件下，對影響黑曲霉菌菌絲球形成的條件進行了研究。基于豆制品廢水簡單操作的原則，考察了孢子濃度、轉速、營養水平對黑曲霉形成菌絲球的影響。研究發現，調整豆制品廢水的營養水平可使黑曲霉形成形態均一的菌絲球。當豆制品廢水COD為2×103mg/L，孢子濃度為1.44×103/L時，在攪拌式發酵罐中黑曲霉能形成形態均一的菌絲球，此時COD可降至842 mg/L，COD去除率55.7%。在豆制品企業中，高濃度廢水經板框過濾、初沉池后，COD約為(2～3)×103mg/L，所以本研究中黑曲霉形成菌絲球時的營養水平與豆制品企業的實際工藝參數相近。不足之處是COD去除率較低，這可能是由于小型發酵罐中溶氧的限制，導致黑曲霉菌代謝速率較慢。在后繼研究中，將發酵規模放大，改善溶氧水平后，有望提高豆制品廢水的COD去除率。

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Soybean product wastewater treatment byAspergillusnigerthrough pellet formation in fermentor

ZHANG Yan1, DIAO Ning-ning1，HUANG Xun-juan1，ZHANG Jian-guo1,2

1.Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, P.R.China；2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology (Tianjin University of Science & Technology,Ministry of Education, Tianjin, 300457, P.R.China

AbstractAspergillus niger pellet is a good approach for soybean wastewater treatment because of its good safety record, easy recovery of pellets morphology, low cost and low sludge production. On the basis of previous research, Aspergillus niger was cultivated in mechanical agitated fermentor to form pellets and treat soybean wastewater. The condition of reducing chemical oxygen demand (COD) of wastewater by using Aspergillus niger pellets was investigated. Research results showed that when the initial COD of wastewater and initial spore concentration were 2×103 mg/L and 1.44×103/L respectively, the uniform mycelium pellets could be observed in the fermentor. COD reduced to 842 mg/L and the removal rate of COD reached 55.7%. This result provided a reference basis for treating soybean wastewater using Aspergillus niger pellets in stirring-type fermentor.

Key wordssoybean products wastewater; Aspergillus niger; pellets; chemical oxygen demand

基金項目：國家自然科學基金(No.21306112)；上海市自然科學基金資助項目(No.13ZR1429100)；上海高校青年教師培養資助計劃(No.slg14037)；教育部留學回國人員科研啟動基金；工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室(天津科技大學)開放基金資助項目(No.2013IM002);上海市研究生教育創新計劃資助。

作者簡介：張燕(1991～)，女，碩士研究生；研究方向：微生物過程工程。E-mail：zhangyan399@foxmail.com。 *通訊作者：張建國，男，副教授。Tel：86-21-55803272，E-mail：jgzhang@usst.edu.cn。