不同硫酸蒽酮比色定糖法的比較

摘 要：為選定適合的實驗室測糖方法，分別采用濃硫酸外加熱法、稀硫酸外加熱法及水合熱法等設置的不同加熱時間對蔗糖標準樣品進行測試，并對其易操作性、數據穩定性等方面進行綜合比較。結果表明，稀硫酸外加熱法由于具有測定數據穩定性好、易于操作、藥品用量少、吸光度值范圍適宜、顯色反應完全等優點，被確定為最合適的實驗方法。

關鍵詞：硫酸蒽酮法；比色定糖；實驗方法

中圖分類號：TG115.3+2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.002

硫酸蒽酮比色法是植物營養和生理代謝中最常用的測糖方法[1-6]，其原理是糖類（包括多糖）在硫酸的作用下，脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，然后蒽酮與糠醛或羥甲基糠醛經脫水縮合產生藍綠色的糠醛衍生物，在620 nm處有最大吸收。顏色深淺可作為定量的標準。該法由于所需試劑簡單，操作方便，并具有較高的靈敏度，適于微量測定，已得到普遍應用。

在很多文獻資料中，都有關于蒽酮比色法的介紹。但是不同作者所介紹的方法中，蒽酮試劑的用量、硫酸的濃度以及不同試劑與糖顯色所需的時間等差異很大。總的來講，可以概括為兩大類，即外加熱法和水合熱法[7]，外加熱法又分為稀硫酸外加熱法[8]和濃硫酸外加熱法[9]。

本試驗通過對3種常見的蒽酮比色定糖法進行比較，旨在找到最適合本化驗室應用的實驗方法。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

標準樣品：濃度分別為0，10，20，30，40，50，60 g·mL-1的葡萄糖標準溶液。

實驗儀器：萬分之一天平，日本島津紫外分光光度計，離心機（4 000 r·min-1），三用恒溫水浴鍋。

實驗試劑：分析純硫酸，分析純蒽酮。

1.2 方 法

方法1 濃硫酸外加熱法：蒽酮試劑以濃硫酸加蒽酮配制，在冰水浴中加入濃硫酸，反應體系中水和硫酸的比例為1∶2.1，沸水浴中加熱進行顯色反應。

方法2 稀硫酸外加熱法：蒽酮試劑以稀硫酸加蒽酮配制，在冰水浴中加入濃硫酸，本體系中水和硫酸的比例為1∶1.73。沸水浴中加熱進行顯色反應。

方法3 水合熱法：蒽酮試劑用濃硫酸加蒽酮配制，在正常室溫下加入濃硫酸，本反應體系中水和硫酸的比例為1∶2.6。顯色反應利用蒽酮試劑中濃硫酸遇水放出的熱。

以上3種方法均以0 μg的糖與蒽酮試劑的室溫顯色液作為零基準。每個試驗方法重復3次，取3次重復的平均值進行分析。具體試劑配比見表1。

2 結果與分析

2.1 濃硫酸外加熱法

在濃硫酸蒽酮試劑的反應體系中，水和濃硫酸的比值是1∶2.11，濃硫酸比例較大，因而水反應較易進行。雖然冰水浴溫度低，但試劑仍可進行顯色反應。在冰水浴中搖勻試管時，試劑溶液明顯變綠，表明反應已經開始。每個樣品加入硫酸蒽酮試劑的操作耗時約0.5 min。當實驗中幾個樣品作為同一個批次加熱時，操作必須嚴格按規程進行，在所有樣品都加入試劑后再同時搖勻，以減少加樣時間差異給顯色反應帶來的誤差。

對數據進行整理后可以看出（圖1），加熱時間在3～5 min時，脫水顯色反應尚未進行完全，消光值較小。當加熱時間持續到8～10 min時，顯色已完成，此時消光值最大。當加熱時間延長到13 min時，消光值又變小了。實驗中也觀察到隨著加熱時間的延長，反應試液的顏色由8 min時的藍綠色變為15 min時的灰綠色。這可能是由于過長的加熱時間引起了糠醛衍生物的破壞，所以顏色逐漸消退[7]。

對不同加熱時間下不同濃度的糖溶液的吸光度值進行相關分析后發現，5～8 min的加熱時間具有較高的相關系數（表2），這說明在5～8 min時反應物比較穩定，數據的重現性好，但5 min時吸光度值較低，說明反應不完全，因此認為，對于濃硫酸加熱法而言，以8 min的加熱時間為最好，而林炎坤[7]、雷剛[10]等則認為3 min的加熱時間吸光度值較高。

2.2 稀硫酸外加熱法

在試驗中我們看到，當稀硫酸蒽酮試劑加入到試管中時，試管中與試劑接觸的糖溶液的顏色沒有發生顯色反應，搖勻后溶液的顏色仍為硫酸蒽酮試劑的顏色。這是因為稀硫酸蒽酮試劑的反應體系中，濃硫酸比例小，水和濃硫酸的比例是1∶1.73，在不加熱的情況下，不會發生脫水反應。因此在加樣過程中的時間差異，不會對顯色反應產生影響，使試驗操作易于控制，減少了誤差的產生。

從圖2可以看出，顯色時間在8 min時，吸光度值仍較低，等到10 min時，消光值最高，11 min以后，消光值又開始下降。以上數據表明，稀硫酸外加熱法加熱10 min時，顯色反應完全。

從表3可以看出，8～10 min的加熱時間具有較高的相關系數，這說明在8～10 min時反應物比較穩定，數據的重現性好。但8 min時吸光度值稍低，顯色反應不完全，因此認為對于稀硫酸加熱法而言，以10 min的加熱時間為最好。

2.3 硫酸水合熱法

在水合熱法中我們看到，當硫酸蒽酮試劑加入到試管中時，室溫下即使不搖勻，試管內溶液也會立即發生顯色反應。這是由于在水合熱的反應體系中，濃硫酸比例大，水和濃硫酸的比例是1∶2.5，因此在不加熱的情況下，硫酸就會與水發生水合作用放出熱能，使反應系統自行升溫達到充分顯色。與前面兩種實驗方法比較起來，水合熱法雖然操作相對方便些（不需加熱），但對操作技術要求高，稍有疏忽，極易造成誤差，測定結果準確性差、不穩定，易受室溫變化的影響[10]。

從圖3可以看出，水合熱法不同濃度糖溶液的吸光度值與反應時間之間的規律性不明顯，含糖量100 μg的糖溶液，反應在進行到15 min時吸光度值最大，而75 μg的糖溶液則13 min時吸光度值最低，但從整體上看以15 min時吸光度值最大。

從表4可以看出，在水合熱法中，不同反應時間下標準樣品中糖含量與吸光度值之間的相關系數比較低，這可能與加樣時間的控制及水合放熱反應不完全有關。

3 討 論

根據上述的實驗結果，可以從以下幾個方面來比較3種實驗方法的優劣。

3.1 操作條件易于控制

稀硫酸與糖溶液樣品混合后，在冰水浴中沒有水合現象，混合后不放熱，試劑不反應，直到放入沸水浴后，才開始顯色，這樣在反應時間上每個試樣就比較統一，實驗條件易于控制，加樣時間的先后，不會對測定結果產生影響。而另兩種實驗方法由于濃硫酸比例大，試劑與糖溶液混合后水合反應劇烈，立即發生顯色反應，試劑加入的先后順序影響到計時，使蒽酮試劑與糖樣的顯色時間難于掌握，因而直接影響到測定結果的準確性。

3.2 測定數據穩定性好

從測定的數據中可以看出，稀硫酸加熱法的最大吸光度值穩定在10 min的加熱時間上，重現性好。從對數據進行的相關分析上也可以看出，不同加熱時間下，不同濃度糖溶液與吸光度值之間的相關系數均達到0.999以上。而其他兩種試劑的最大吸光度值不穩定，重現性差，相關系數偏低。這也說明了稀硫酸加熱法10 min時測定的數據穩定性最好。

3.3 藥品用量經濟

3種試驗方法中，水與濃硫酸的比例分別為1∶2.11、1∶1.73和1∶2.6。每配制100 mL硫酸蒽酮試劑，硫酸用量分別為95，76，100 mL。因此，配制同樣體積的試劑，稀硫酸外加熱法硫酸消耗量最少，從試驗成本上來講最經濟。

3.4 樣品體積方便比色

3種試驗方法中，顯色后溶液的體積都不大，分別為7，6，9 mL。因此，每次潤洗比色杯時都要小心進行，既要充分潤洗，又要保證有充足的樣品體積進行比色。相對而言，稀硫酸法體積量最小，比色時對操作技術要求最高。

3.5 顯色反應進行完全

從測定的數據可以看出，外加熱法顯色反應的吸光度值要普遍高于水合熱法。這說明水合熱法水合放熱的能量有限，顯色反應不夠完全。

按上述條件綜合比較后認為，稀硫酸外加熱法雖然樣品體積量小，比色時要控制樣品用量，但由于具有測定數據穩定性好、易于操作、藥品用量少、吸光度值范圍適宜、顯色反應完全的優點，仍然是最適合本實驗室應用的測糖方法[11]。

參考文獻：

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