牛場肥水灌溉對土壤反硝化細菌nosZ基因組成結構和多樣性研究

王婷++劉麗麗++高文萱

摘 要：以河北省徐水縣長期定位施肥試驗田為研究對象，利用末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）分析和克隆文庫構建，研究了5種施肥處理（清水灌溉CK、無機肥灌溉CF、不同牛場肥水灌溉T4、T5和T11）下土壤中nosZ型反硝化細菌群落多樣性及其群落結構演變。結果表明，不同施肥處理下nosZ型反硝化細菌群落多樣性無顯著性差異，施肥條件對nosZ型反硝化細菌的群落結構無明顯影響，說明本試驗土壤中nosZ型反硝化細菌對施肥不敏感，群落穩定。系統發育分析結果表明，nosZ型反硝化細菌主要與假單胞菌屬（Pseudomonas）具有較近的親緣關系。

關鍵詞： nosZ；反硝化細菌；牛場肥水灌溉；T-RFLP；群落多樣性

中圖分類號：S155.4+4 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.004

反硝化作用是微生物在嫌氣條件下進行的硝酸鹽還原過程，在多種微生物參與下，將硝酸鹽亞硝酸鹽逐步還原，最終將氮以一氧化氮（NO）、氧化亞氮（N2O）或分子態氮（N2）的形式釋放出來的過程[1-3]。反硝化作用微生物主要分布于水體、沉積物和土壤中，由于土壤的環境更適合微生物的生存[4]，所以反硝化作用主要發生于土壤中。研究表明土壤因反硝化作用而喪失了20%～30%的氮肥[5]，全球70%的N2O排放來自土壤[6]，Stehfest和 Bouwman[7]指出，施肥農田土壤每年釋放N2O-N 和 NO-N 的量分別達到 3.3 和 1.4 Tg。農田土壤是重要的溫室氣體[二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）、氧化亞氮（N2O）]的源匯[8]。因此，深入研究農田土壤反硝化的作用及其影響因素，可以為我們減少 N2O 的排放找到新途徑，對于保護地球生態非常重要。

隨著集約化飼養程度的不斷提高，養殖廢物發酵產生的沼液作為一種優質的有機液體肥料進行水肥還田在很多國家和地區得到應用和推廣[9-10]。研究發現，相比不施肥和常規施肥，沼液能夠提高作物質量，影響土壤微生物[11-13]，而液態牛場肥水灌溉對反硝化微生物的影響幾乎沒有相關報道。

由于nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶催化N2O向N2轉化，將溫室氣體N2O 轉化為無害的 N2，是反硝化細菌的重要酶[2]。目前已有不少研究者通過研究 nosZ 基因的多樣性來探究反硝化細菌的群落結構和多樣性，比如Ruiz-Rueda 等[14]通過對nosZ的 PCR-DGGE 研究，發現植被存在可以促進微生物的硝化和反硝化作用。Enwall 等[15]發現長期施用有機肥改變了 nosZ型反硝化細菌的群落結構，提高土壤的反硝化潛勢。

筆者以河北省徐水縣長期定位試驗田為研究對象，利用T-RFLP和構建克隆文庫方法，探明了按當地農民習慣施肥以及不同灌溉次數、不同濃度的牛場肥水灌溉的施肥方式下，冬小麥/夏玉米大田0～5 cm土層中nosZ型反硝化細菌群落的多樣性和組成變化，為深入探討牛場肥水灌溉施肥對大田反硝化作用影響提供相應依據，并為大田合理施肥、提高牛場肥水灌溉效果以及減少 N2O 的排放提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 試驗設計與土壤樣品采集

本試驗以徐水縣梁家營長期定位施肥試驗田為研究對象。徐水縣地處太行山東麓，河北省中部，北緯38°09′～39°09′，東經115°19′～115°46′，屬大陸性季風氣侯，年平均氣溫11.9 ℃，年均降水量546.9 mm，年日照時數平均2 744.9 h。

試驗田每個小區長9 m，寬6 m，面積54 m2，四周1 m土體內用塑料布隔開，種植方式為冬小麥/夏玉米輪作。共設5個處理，施肥方式及灌溉肥水沼液原液成分見表1和表2。

土壤樣品在小麥收割后（6月中旬）進行采集，采用5點法采集土樣，每個小區隨機選取5點采集0～5 cm的表層土，去除根系、雜草、土壤動物和石塊等雜質后混勻，于20 ℃冰箱保存。

1.2 土壤微生物總DNA提取

土壤微生物總DNA的提取方法和步驟按照土壤基因組DNA提取試劑盒FastDNAR SPIN Kit For Soil （MP Biomedicals，LLC）的說明進行。將提取的DNA用Nano Drop核酸蛋白儀（ND-1000）測定濃度及質量，于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 末端限制性酶切片段多態性（T-RFLP）

按照表3進行PCR擴增，擴增產物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進行純化回收，并用Nano Drop核酸蛋白儀（ND-1000）檢測純化產物濃度及質量。產物回收后，擴增產物用內切酶HhaⅠ（TaKaRa）進行酶切，反應體系和條件按各內切酶說明書進行。將酶切產物送去生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

通過計算Shannon-Wienner、Simpson和Pielou多樣性指數模型獲得nosZ型反硝化細菌群落多樣性指數。

1.4 克隆及測序分析

將1.3目的條帶分別進行切膠回收，用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進行純化，純化后的產物分別與pMD19R-T Vector載體進行連接反應。

將10 μL連接產物分別轉化到100 μL大腸桿菌JM109感受態細胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上37 ℃過夜培養后進行藍白斑篩選，挑取白斑克隆子，用通用引物M13F（5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′，TaKaRa），M13R（5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′，TaKaRa）進行菌落PCR擴增，選取大約100個克隆子擴大培養后送去生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。