氦氖激光對退變顳下頜關節BMP-2表達的影響

毛凱平，鄒璟，李解，姜夢雅，高桃珍

顳下頜關節骨關節病(temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJOA)是指顳下頜關節組織發生磨損與變形，并在關節表面形成新骨的非炎癥性骨關節病。由于顳下頜關節結構與功能復雜，加之人的一生中牙合型不斷發生改變，顳下頜關節經歷了復雜的改建過程，以致其發病率高達30%，嚴重影響患者的生活質量[1]。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解、組織改建是TMJOA最重要的病理改變。文獻證實，基質調節因子通過影響細胞外基質降解及合成導致基質成分紊亂及功能改變，在TMJOA發生與發展中起著主要作用[2-7]。氦氖激光是臨床治療TMJOA的常用手段之一，但其作用機制尚不完全清楚，本研究通過觀察氦氖激光對退變顳下頜關節細胞外基質基質調節因子骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表達的影響，以期明確氦氖激光對顳下頜關節退變的保護作用與機制，為臨床運用氦氖激光治療顳下頜關節骨關節病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：選用骨骼發育成熟的健康成年雄性新西蘭大白兔40只，月齡5～6個月，體質量2～2.5kg，無牙頜畸形，由武漢大學實驗動物中心提供(合格證號42000500002225)。②主要試劑： 羊抗兔BMP-2單克隆抗體(武漢博士德生物公司，貨號：BA0585)、鼠抗羊二抗(KPL公司)。③主要材料與儀器：PVDF膜(Millipore 公司)、氦氖激光多功能治療儀(MDC-500)。

1.2 方法 ①分組與處理：在標準條件下(武漢市第一醫院中心實驗室)適應性飼養3周后開始實驗，實驗過程中的程序經過了武漢市第一醫院實驗動物倫理委員會審批。所有動物進行編號，查隨機數字表分為4組各10只。正常組，自然飼養，不作任何治療；模型組，模型，不作任何治療；假模型組，同模型組，但不切除關節盤，不作任何治療；治療組，于造模后第1d開始氦氖激光治療，連續治療10d。各組分別在造模后第1天和11天兩個時間點各取5只，將實驗動物以過量注射麻醉藥方法處死，取各組髁突，直接凍存于-80℃冰箱待檢測。②造模：參照常嘉等[8]的造模方法，建立顳下頜關節骨關節病動物模型。于耳緣靜脈注射1mg/kg的2.5g/L的戊巴比妥鈉。無菌條件下自眼外眥外側5mm處至外耳道方向行2cm長的皮膚切口，分離皮下組織，暴露關節囊。水平切開關節囊，切開關節盤的外側附著，將下頜升支推向外側以充分暴露髁突關節面與關節盤。將關節盤前外二分之一部分切除。無菌生理鹽水充分沖洗后將剩余關節盤復位，分層縫合關節囊、皮下組織和皮膚。假模型組僅作關節囊切開后即縫合組織。術后不限制動物的下頜運動，飼養顆粒性常規兔飼料，單籠飼養。連續肌肉注射青霉素3天，每天4萬單位。于術后1個月行顳下頜關節CT檢查，出現典型的TMJOA改變即進行后續實驗，未出現TMJOA改變的動物予以剔除。③治療方法：采用氦氖激光多功能治療儀(MDC-500)，輸出氦氖激光波長632.8nm，功率10mw，激光光針光斑直徑2mm。取患側頰車、上關、下關、聽宮、翳風，光針緊貼皮膚并與之垂直，每穴照射5min，共治療10d。

1.3 評定標準 Western Blot方法進行檢測BMP-2蛋白表達量：按蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，根據預染marker顯示，充分分離目的蛋白，取出凝膠用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數秒后和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中。然后用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h。再加入一抗孵育，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗——1:40000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，顯色曝光。BandScan凝膠圖像分析軟件分析膠片灰度值。

2 結果

2.1 模型兔顳下頜關節CT表現 模型兔于術后1個月行三維CT檢查，顯示關節軟骨逐漸消耗、喪失，出現缺損，關節軟骨表面粗糙，光澤度變差，髁突形態改建、軟骨層增厚明顯，患側髁突外觀肥大，見圖1A～C。

圖1A～C A和B分別為模型組健側(左側)、患側(右側)顳下頜關節三維CT表現，圖C為CT平掃，可見患側髁突形態明顯改變、軟骨層增厚明顯，髁突肥大。

2.2 氦氖激光治療對BMP-2表達的影響 Western blot檢測顯示，正常組和假模型組各時間點BMP-2蛋白表達均無顯著性變化；造模成功后第1d時間點，模型組與氦氖激光組BMP-2蛋白表達均明顯減少，經過氦氖激光治療10d后，BMP-2蛋白表達較第1d及模型組明顯上升(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2 各組不同時間點BMP-2蛋白表達

組別1d11d正常組 11.010±0.125假模型組 1.066±0.1910.982±0.096模型組 0.574±0.122a0.532±0.133a氦氖激光組0.506±0.074a0.736±0.081b

與正常組比較，aP<0.05; 與模型組及氦氖激光組第1d比較，bP<0.05

3 討論

盡管顳下頜骨關節病的機制尚未完全闡明，但髁突軟骨細胞對基質合成與降解代謝調控的失衡被認為是其主要病理環節[9]。文獻證實，髁突軟骨細胞是顳下頜骨關節軟骨基質成分的惟一來源，顳下頜骨關節病的發生即為髁突軟骨細胞所控制的合成、降解代謝失衡所致，其主要特征為關節軟骨細胞外基質成分的進行性降解，同時伴隨著繼發性炎癥因子的釋放及其相關效應[9]。

臨床研究表明，氦氖激光對顳下頜骨關節病具有良好的治療作用[10]，其作用機制值得進一步深入研究。已有研究顯示，氦氖激光光針釋放出的激光光子能量被病態的生物分子吸收后，可改變病態生物分子內能，這種改變相當于一種刺激源，可直接或間接興奮神經、肌肉和腺體，同時，可使鉀離子致解反應時間顯著延長，使五羥色胺物質明顯降低，激活內源性嗎啡樣鎮痛物質，延長感覺神經潛伏時間，整合中樞神經的痛覺信號，從而達到鎮痛效果，并通過促進新生血管的形成改善顳下頜關節患者局部血液循環，通過抑制固有炎癥介質PGE的合成及直接抗炎作用，降低炎癥反應[11]。

BMP-2作為細胞外基質調節因子，同時也是合成代謝酶，可促進細胞外基質合成，并能誘導未分化的間質細胞不可逆的分化為軟骨細胞和成骨細胞。對骨組織的發生、損傷和修復都具有重要作用。其對骨原細胞的分化起著決定性作用，是促進成骨的主要因子，可在骨損傷局部和異位促進細胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，是唯一能夠單獨在異位誘導成骨形成的分子。這使其在骨關節病的臨床治療中具有極大的潛在應用價值[12-13]。

綜上所述，退變的顳下頜關節組織中，BMP-2蛋白表達較正常顳下頜關節明顯降低，證實了BMP-2蛋白表達下降所致ECM合成減少是顳下頜關節骨關節病的機制之一。正常組與假模型組之間二者的表達無顯著性差異，說明未切除關節盤的顳下頜關節模型無明顯的退變。選用氦氖激光照射患側頰車、上關、下關、聽宮、翳風穴10d后，顳下頜關節組織中BMP-2蛋白表達明顯增加，表明氦氖激光治療可上調退變顳下頜關節細胞外基質BMP-2蛋白表達，促進細胞外基質合成，從而防治顳下頜關節骨關節病。本研究為臨床運用氦氖激光治療TMJOA提供了一定的理論依據，但氦氖激光影響相關蛋白表達的具體機制仍需進一步研究。

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