鼻咽癌高癌家系外周單個核細胞蛋白質組學研究

蘭炎根，陳舒華，陳凱，田道法，何迎春，黃冬云

(1.梅州市人民醫院耳鼻咽喉一科，廣東 梅州 514000；2.佛山市第二人民醫院耳鼻咽喉科，廣東 佛山 528000；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410008)

鼻咽癌高癌家系外周單個核細胞蛋白質組學研究

蘭炎根1，陳舒華2，陳凱1，田道法3，何迎春3，黃冬云1

(1.梅州市人民醫院耳鼻咽喉一科，廣東 梅州 514000；2.佛山市第二人民醫院耳鼻咽喉科，廣東 佛山 528000；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410008)

目的 尋找鼻咽癌高癌家系鼻咽癌的癌變機制、早期診斷、治療和預后監測的外周血特異性分子標志物。方法 利用雙向凝膠電泳技術(2-DE)分別分離鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照組外周血單個核細胞的總蛋白，經藍銀染色后進行圖像分析，并對差異表達的蛋白質點進行識別，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜得到肽質量指紋圖譜，搜索數據庫鑒定部分差異蛋白質點。結果 建立了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照組外周血單個核細胞的2-DE圖譜；發現并鑒定了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照組之間的差異表達大于2倍的蛋白質點19個，這些差異蛋白質點主要為蛋白質合成與分解、抗氧化應激、分子伴侶、細胞結構相關蛋白質、三大代謝相關酶類以及信號傳導相關蛋白質等。結論 通過對鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對照組外周血單個核細胞的比較蛋白質學研究，篩選并鑒定到19個與鼻咽癌高癌家系鼻咽癌發生相關的蛋白質，其中HSP27、Protein S100-A9、Prohibitin可能成為鼻咽癌高癌家系鼻咽癌癌變機制、早期診斷、治療及預后監測的外周血特異性分子標志物。

鼻咽癌；高癌家系；外周血單個核細胞；蛋白質組學

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種主要來源自鼻咽黏膜上皮細胞癌變的惡性腫瘤，據研究統計其致死率約占全部惡性腫瘤致死率的2.81%，在我國的癌癥致死疾病中排名第八，在頭頸惡性腫瘤中一直是首要致死腫瘤。研究表明，鼻咽癌病例的80%以上發生在我國，是國內重點防治的十大惡性腫瘤之一。鼻咽癌發病率多發生于我國南方地區，以廣東省最高，其次依次是廣西、湖南、福建、江西等省區。鼻咽癌的男性發病率超過0.03%，在女性達到0.015%以上。通常情況下鼻咽癌可發生于各年齡階段，年齡跨度3～90歲，但30～50歲為鼻咽癌發病高峰年齡段，另外有研究表明鼻咽癌發病還表現出明顯的家族聚集現象[1-2]，且這種聚集性在不同人種中均有發生。分析已發表的文獻可知鼻咽癌高癌家系中的鼻咽癌大概占總鼻咽癌發病數的7.7%。鼻咽癌患者的一級親屬是患鼻咽癌的高危人群，源于鼻咽癌患者的高家族聚集性[3]。調查研究顯示：約10%的鼻咽癌患者具有癌家族史，其中約有50%具有鼻咽癌家族史，而大部分患者集中在一級親屬。因此，鼻咽癌高癌家系中鼻咽癌患者的早發現和診斷對其治療和預后具有極其重要的意義。

在本研究中，我們應用分離純化的方法提取鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和鼻咽癌高癌家系成員外周血淋巴細胞的蛋白，并以健康人作為對照，經雙向凝膠電泳(2-DE)雙得到分辨率和重復性較高的圖譜，利用PDQuest軟件比較分析圖譜中差異表達量兩倍以上的蛋白點，并用MALDI-TOF-MS質譜儀進行蛋白分析，鑒定相關的蛋白質，為研究鼻咽癌高癌家系腫瘤發生機制奠定基礎，同時也為臨床對鼻咽癌高癌家系高危人群鼻咽癌的早期發現、早期診斷以及尋找藥物治療耙標提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 鼻咽癌高癌家系選定標準在先證鼻咽癌患者的一級親屬中(包括父母，同胞兄弟姊妹，子女)，有2人以上(含2人)經病理活檢確診為鼻咽癌的家系。以26例2008-2009年在佛山市第二人民醫院耳鼻喉科門診確診為鼻咽癌的病例為研究對象。研究分為三組，第一組為鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者，共計11個家系，11人，其中男性9人，女性2人，平均年齡(46.47±12.85)歲；第二組為鼻咽癌高癌家系核心成員(包括父母、子女及同胞)，共計15人，其中女性7人，男性8人，平均年齡(44.45±13.49)歲；第三組為正常人組，共計15人，其中男性9人，女性6人，平均年齡(50.74±11.03)歲。

1.2 試劑 Amersham Biosciences公司產品：Sample Grinding Kit組織研磨試劑盒、2D Quant Kit蛋白定量試劑盒、Triton X-100、NP-40、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、硫脲、IPG緩沖液(pH3-10NL)、兩性電解質(pharmalyte，pH3-10)、覆蓋液、碘乙酰胺、固相pH梯度干膠條(IPG strip pH3-10NL，24 cm)、雙向凝膠電泳標準蛋白質均；Sigma-Aldrich公司產品：丙烯酰胺、硫代硫酸鈉、碳酸氫銨、CHAPS、SDS、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲-酮-胰蛋白酶(TPCK-Trypsin)、基質а-氰基-4-羥基肉桂酸、甘氨酸、Tris、三氟乙酸、鐵氰化鉀、甲叉雙丙烯酰胺；碳酸鈉、硝酸銀、甘油、甲醛、EDTA二鈉、戊二醛、乙醇和乙酸均為國產分析純級別。

1.3 儀器 Applied Biosystem公司的 MALDI-TOF-MS質譜儀(Voyager-DE STR 4307)；PDQuest 7.0凝膠圖像分析軟件(Bio-Rad公司)；Imagescanner掃描儀、IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT垂直電泳槽均為Amersham Biosciences公司產品。

1.4 方法

1.4.1 外周血單個核細胞的分離 在無菌條件下采集靜脈血10 mL，加入含有肝素的無菌抗凝管中，立即輕輕搖勻樣品。加入等體積無菌D-Hank's液(NaCl 8.0 g，NaH2PO4·12H2O 0.134 g，KH2PO40.06 g，KCl 0.4 g，NaHCO30.35 g，溶于1 000 mL超純水)。抽取淋巴細胞分層液8 ml加入離心管(50 mL)中，沿管壁慢速加人稀釋血液，保持分離界面穩定，使兩種樣品不相混，在20℃2 000 r/min條件下離心30 min，吸取淋巴細胞層加人50 mL離心管中，用5倍體積的D-Hank's液洗滌兩次，室溫條件下依次在2 000 r/min和1 500 r/min離心10 min，將混雜的血小板去除，將10 mL超純水混合細胞團塊1 min后迅速加入等體積的1.8%NaCl溶液，2 000 r/min離心后棄上清，-80°C保存備用。

1.4.2 抽提細胞總蛋白 使用組織裂解液提取鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系親屬及正常人外周血淋巴細胞中的總蛋白質，組織裂解液含：7 mol/L尿素、二硫蘇糖醇、5 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，2 mol/L硫脲、2%NP-40、100 mmol/L DTT、4%CHAPS、1%Triton X-100、40 mmol/L Tris、2% Pharmalyte、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。渦旋充分混勻后置于冰上孵育1 h后12 000 r/min，4℃條件下離心1 h，吸取上清移入新EP管中。吸取5 μL上清，使用2D Quant Kit定量試劑盒測定蛋白的濃度。

1.4.3 雙向凝膠電泳和質譜分析 主要參照文獻[4]的方法。

1.4.4 圖像分析 使用Imagescanner掃描儀進行掃描；通過點檢測、匹配、量化比較獲取斑點的相關信息，分析使用PDQuest圖像分析軟件進行。所有統計數據的分析均由Excel 2000軟件完成。

1.4.5 數據庫查詢 使用軟件Mascot Distiller對肽質量指紋圖譜(PMF)進行單同位素峰識別，將所獲得的肽端的質荷比(m/z)數值輸入Mascot質譜搜索軟件(Matrixscience)進行分析，從數據庫為物種來源為人類的SWISS-PROT的Uniprot和NCBI非冗余蛋白質數據庫進行搜索，條件：最大允許肽段質量誤差100 ppm，選擇[M+H]+離子種類和單同位素峰，選擇半胱氨酸碘乙酰胺化為固定修飾，最大允許的漏切的胰酶酶切位點數為1。

2 結果

2.1 雙向凝膠電泳圖譜及差異蛋白質點 雙向凝膠電泳將外周血單個核細胞總蛋白質進行了分離，考馬斯亮藍染色后得到分辨率高、重復性好、背景清晰的鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及正常人組2-D凝膠圖譜各3塊。PDQuest圖像分析顯示：9塊膠的平均點數為(1 224±45)，各組之間擁有(92±1.6)%的平均匹配率。計算統計三塊膠后得到組內的雙向電泳凝膠的平均膠(即組內凝膠上的同一蛋白質點的平均表達量)，某個蛋白質點的表達量按照公式：膠上的灰度體積=面積×灰度進行統計，最終得到鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及正常人組外周血單個核細胞表達變化差異大于兩倍的蛋白質點共22個(圖1)。各組人外周血單個核細胞雙向凝膠電泳圖譜及差異蛋白質點，400 μg總蛋白質經第一相pH3-10NL等電聚焦和二相10% SDS-PAGE分離后，經考馬斯亮藍染色和后續掃描后，PDQuest軟件分析顯示每塊膠平均點數為1 245個。

2.2 差異蛋白質點的MALDI-TOF-MS質譜鑒定及數據庫查詢 經MALDI-TOF-MS質譜儀分析后差異蛋白質點得到PMF圖譜后，使用Mascot質譜搜索引擎搜索SWISSPROT的Uniprot數據庫，鑒定得到19個蛋白質。5號蛋白質點的PMF圖譜和SWISSPROT數據庫中的搜索結果分別見圖2和圖3，19個得到鑒定的差異表達蛋白質的名稱和表達量變化的倍數見表1和表2。

圖1 三組研究對象2-DE圖注：a，高癌家系癌患者組2-DE圖；b，高癌家系癌患者成員組2-DE圖；c，健康家系對照組2-DE圖。

圖2 質譜分析所得第5號蛋白質點的PMF圖譜注：峰旁標示數字表明了肽段的單同位素峰[M+H]+的質量數。

圖3 第5號差異點在SWISSPROT的Uniprot數據庫中的搜索結果注：質譜分析得到蛋白質點5的PMF經Mascot質譜搜索引擎搜索蛋白數據庫得到蛋白質的得分情況(98分)，鑒定為Protein S100-A9。

表1 鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者組對正常人組差異蛋白質點的鑒定

表2 鼻咽癌高癌家系成員組對正常人組差異蛋白質點的鑒定

3 討論

本研究中使用患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)作為研究樣本，這就使得不同患者間出現個別差異性蛋白，患者的雙向電泳凝膠圖像重復性不太好。同時受限于臨床標本采血量的限制，單例患者分離得到的單個核細胞數量大約為10×106個，總蛋白為200～400μg。本研究實驗成本較高，為充分分析研究樣本，又使得研究結果具有良好的代表性，采取了將一部分3～5人提取總蛋白混合后再上樣進行雙向電泳凝膠的方法，這樣在有效保證了在高分辨率的情況下使得雙向凝膠電泳的又具有良好的可重復性高，也使具有意義的差異表達蛋白質能更明顯地呈現出來。混合外周血單個核細胞研究的優點在于，不僅在同樣研究條件情況下盡可能多增加樣本分析數量，這就能消除一些非特異性干擾，使有意義的蛋白質在多樣本的情況下表達情況得到更好的保證，使研究結果更加能夠代表總體真實情況。另外對于利用蛋白質組學技術對疾病蛋白標志物或耐藥蛋白質進行篩選，這種多樣品混合的方式也是一個比較經濟可行的方案，但是個體情況不能很好地反映出來。本研究獲得了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和成員，以及正常家系成員的PBMC蛋白質表達譜情況，重復性較好。外周血單個核細胞凝膠的平均蛋白質點數分別為(1 224±45)、(1 249±43)和(1 180±4)，分別對應92.8%、91.9%和91.6%的組內平均匹配率。雙向電泳凝膠進行顯色采用改進的考染方法，其靈敏度優于傳統的考染方法，源于膠本身著色較淺，背景去除較干凈。改進的考馬斯亮藍法染色與傳統的染色方法相比，優勢明顯，其靈敏度達到Ing/蛋白點。使用PDQuest軟件對差異表達點進行分析后，隨機選取22個差異點進行質譜的質量指紋圖測定，19個蛋白得到鑒定，表達明顯增強有10個，明顯下降的有9個，這些差異蛋白質點主要為蛋白質合成與分解、代謝相關酶類、信號傳導、抗氧化應激反應、細胞結構相關蛋白質和分子伴侶相關蛋白質六類，經進一步分析19個蛋白中的HSP27、Protein S100-A9、Prohibitin可能成為鼻咽癌高血特異性標志物。

分子伴侶(molecular chaperones)是進化上非常保守的蛋白質，廣泛分布于各種生物體內，能夠結合和穩定其他蛋白質的不穩定構象，參與細胞器中蛋白質的跨膜運輸。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一大類分子伴侶，共分為五類，分別為HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白(small heat shock proteins，sHSPs)。熱休克蛋白主要是細胞在應激原特別是環境高溫誘導下所生成的一組蛋白質，對維持細胞的存活必不可少。本研究中發現的HSP27屬于sHSPs亞家族，參與調控細胞的增殖、分化和凋亡及信號轉導，因此可能與多種腫瘤的產生相關。研究發現HSP在鼻咽癌中上調表達并與鼻咽癌發生危險度有一定程度的相關性[5]。HSP27蛋白在鼻咽癌中的作用機理有多種可能性：一種可能是作為應激蛋白對腫瘤病理性刺激的一種自我保護性反應，在腫瘤發生的個體中反應性地發生作用。另外一種可能性是與細胞凋亡密切相關。本研究中鑒定出HSP27和HSC70兩個熱休克蛋白，在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者的PBMC中HSP27及HSC70的表達量上調明顯，相對健康人組的表達水平，HSP27在鼻咽癌高癌家系成員組中也上調明顯，與Hela細胞中發生的情況相同[6]。從相關研究可見，HSP27不僅可以參與蛋白質的折疊組裝和運輸，也可能與腫瘤的發生和發展密切相關，其功能十分多樣化[7-9]。HSP27能使谷胱甘肽水平增加，對細胞的自我解毒也有作用[10]，對腎臟上皮細胞粘附和增殖具有促進作用，從而抑制其凋亡[11]。本研究發現在鼻咽癌高癌家系中鼻咽癌高癌家系成員及鼻咽癌患者HSP27表達逐漸明顯增強，推測HSP27可能對癌細胞的增殖有促進作用，與細胞的解毒、修復及抑制凋亡可能也有關聯，還需要后續的研究證明其具體的功能。

抗增殖蛋白基因(prohibitin，Phb)是一種潛在的抑癌基因，能在細胞增殖、分化與凋亡過程中發揮重要作用[12]。抗增殖蛋白基因定位于17q21，與卵巢癌和乳腺癌易感基因(BRAC1)轉座子相鄰[13]，主要通過阻斷DNA合成而對細胞增生起負性調節作用[14]。抗增殖蛋白在細菌、植物、酵母、原蟲及哺乳類等生物細胞中都有存在。抗增殖蛋白的氨基酸結構十分保守，屬于新型的分子伴侶蛋白，還具有轉錄調控作用。本研究在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者組和成員組中均檢測出抗增殖蛋白，同時發現其表達量逐漸增強。巧合的是在已有的研究報道中也發現抗增殖蛋白在肝細胞癌[15]、乳腺癌[16]和胃癌[17]的細胞系中亦同樣有高表達，這就表明抗增殖蛋白屬于抑癌蛋白，在于腫瘤組織及腫瘤細胞系中廣泛存在。推測在鼻咽癌高癌家系中抗增殖蛋白基因可能發生了基因突變或者蛋白質合成，使之不能行使正常的功能。它在腫瘤發生發展過程中出現早，這就證明抗增殖蛋白很有可能作為鼻咽癌高癌家系鼻咽癌早期診斷的標記物,但是需要更進一步的更大樣本的試驗檢驗和驗證。

鈣結合蛋白S100A9是一個含有114個氨基酸殘基分子量約為13 000的蛋白，其鈣離子的結合位點由兩個EF手型基序結構組成。鈣結合蛋白S100A9是將細胞內鈣離子濃度改變作為中介信號，從而轉換其激動或抑制作用。已有的研究報道表明S100A8和S100A9在肌細胞粘附、收縮、增殖分化及癌細胞轉移中可能發揮重要作用，有關鈣結合蛋白與癌癥的研究也主要集中于食道癌、膀胱癌、前列腺癌和胃癌的研究中[18-20]。本研究鑒定出的差異蛋白S100A9在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和鼻咽癌高癌家系成員組中表達量逐漸增強，且鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者組的表達量明顯高于鼻咽癌家系成員組，提示S100A9蛋白可能在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌發生過程中起重要作用。

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Study on proteome of human peripheral blood mononuclear cells in familial nasopharyngeal carcinoma.

LAN Yan-gen1,CHEN Shu-hua2,CHEN Kai1,TIAN Dao-fa3,HE Ying-chun3,HUANG Dong-yun1.1.Department of Otolaryngology,Meizhou People's Hospital,Meizhou 514000,Guangdong,CHINA;2.Department of Otolaryngology,the Second People's Hospital of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA;3.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410008,Hunan,CHINA

Objective To look for reliable peripheral blood biomarkers for early diagnosis,treatment,mechanism of cancerization and evaluation of nasopharyngeal carcinoma(NPC)from familial nasopharyngeal carcinoma. Methods The proteins of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in nasopharyngeal carcinoma(NPC)from familial nasopharyngeal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults groups were separated by two-dimensional gel electrophoresis(2DGE),respectively.Then gels were stained by blue silver,scanned by ImageScanner and analyzed with PDQuest software.Relative abundance of the protein spots between familial nasopharyngeal carcinoma and health members of familial nasopharyngeal carcinoma groups,and between health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults groups were calculated by comparing spots density volume on the gel. The differentially expressed protein spots were identified by peptide mass fingerprint(PMF)based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and database searching.Results Well-resolved and reproducible 2DGE maps of PBMC from patients with NPC from familial nasopharyngal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults were acquired.Nineteen more than 2 folds differentially expressed protein spots were identified.Some of these proteins participated protein synthesis and degradation,or chaperone,or protection and detoxification,or cytoskeleton,while some of those were involved in metabolism or signal transduction.Conclusion Through comparative proteomic analysis of PBMC in patients with NPC from familial nasopharyngal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults,19 aging related colonic epithelial proteins were identified.HSP27,Protein S100-A9,Prohibitin may become reliable peripheral blood biomarkers for early diagnosis,treatment,mechanism of cancerization and evaluation of NPC from familial nasopharyngeal carcinoma prognosis.

Nasopharyngeal carcinoma(NPC);Familial;Peripheral blood mononuclear cells;Proteomics

R739.63

A

1003—6350（2016）15—2419—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.004

2016-03-17)

國家自然科學基金（編號：30572408）

蘭炎根。E-mail：775333764@qq.com