IL-6基因634C/G多態(tài)性與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)性研究

安新煥，丁俊彩，武彥峰，梁干雄

(1.中山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 中山 528400；2.中山市人民醫(yī)院兒科，廣東 中山 528400；3.北京市理化分析測試中心，北京 100094)

IL-6基因634C/G多態(tài)性與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)性研究

安新煥1，丁俊彩2，武彥峰3，梁干雄1

(1.中山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 中山 528400；2.中山市人民醫(yī)院兒科，廣東 中山 528400；3.北京市理化分析測試中心，北京 100094)

目的 探討白細(xì)胞介素-6(IL-6)基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的關(guān)系。方法 收集2014年1月至2015年1月我院收治的125例2型糖尿病無周圍神經(jīng)病變患者(DPN0組)，83例2型糖尿病周圍神經(jīng)病變患者(DPN組)及101例健康對照者(NC組)，采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測其IL-6基因啟動子區(qū)-634C/G多態(tài)性，比較分析各組間基因型頻率、等位基因頻率以及相關(guān)臨床資料。結(jié)果 DPN0組的GG基因型頻率(16.0%)明顯高于NC組的4.0%(P＜0.05)，DPN0組(34.4%)、DPN組(33.1%)的G等位基因頻率均明顯高于NC組的22.3%(P＜0.05)，但DPN0和DPN兩組間G等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 IL-6基因啟動子區(qū)-634 G/G基因型不是廣東漢族人群DPN發(fā)生的遺傳危險因素，但G等位基因可能是DPN發(fā)生的遺傳危險因素之一。

白細(xì)胞介素-6；基因；啟動子區(qū)；多態(tài)性；糖尿病周圍神經(jīng)病變

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者最常見的慢性并發(fā)癥之一。10年以上糖尿病病程的患者常有明顯的臨床糖尿病神經(jīng)病變，2001年對國內(nèi)住院患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，61.8%的2型糖尿病患者并發(fā)神經(jīng)病變[1]，國外學(xué)者報道24.7%～81.8%的糖尿病患者發(fā)生周圍神經(jīng)病變[2]。IL-6是一種炎性細(xì)胞因子，可促使氧化應(yīng)激增強(qiáng)，而氧化應(yīng)激及低度炎癥狀態(tài)是DPN發(fā)生的機(jī)理之一，本文旨在檢測IL-6基因-643C/G的多態(tài)性，以探討在中國廣東地區(qū)漢族人中此基因多態(tài)性與DPN之間是否有關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2015年1月我院收治的2型糖尿病患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)1999年 WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷2型糖尿病；依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.中國2型糖尿病防治指南2013年版糖尿病周圍神經(jīng)病變診斷及排除標(biāo)準(zhǔn)診斷糖尿病周圍神經(jīng)病變。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)將入選的208例T2DM患者分為無糖尿病周圍神經(jīng)病變組(DPN0)125例，其中男性63例，女性62例，平均年齡(56.38±14.91)歲,糖尿病周圍神經(jīng)病變組(DPN)83例，其中男性37例，女性46例，平均年齡(60.82±15.11)歲。以體檢血糖、血脂、血生化指標(biāo)正常，無糖尿病、高血壓病家族史的101例作為健康對照組(NC組)，其中男性56例，女性45例，平均年齡(47.5±8.21)歲，彼此間無親緣關(guān)系。

1.2 方法 模板DNA用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取。PCR-RFLP方法檢測基因多態(tài)性。北京市理化分析測試中心合成引物，上游引物5'-GAGAC-GCCTTGA AGTAACTG-3'，下游引物5'-AACCAAAGATG TTCTGAA CTGA-3'。PCR反應(yīng)體系：50 μL反應(yīng)體系中引物濃度為30 μmol/L，56 μmol/L的dNTP濃度，加入5 U的Taq酶，94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，終末72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)后，在20 μL酶切體系中加4 μL產(chǎn)物用5 U的酶消化9 h，在紫外檢測系統(tǒng)中觀察結(jié)果(見圖1)。PCR擴(kuò)增的目的片段長度為180 bp，CC基因型只有180 bp一條片段，CG基因型有180 bp、120 bp、60 bp三條片段，GG基因型有120 bp和60 bp兩條片段(60 bp片段看不到)。并測序確定CC基因型和GG基因型(見圖2)。

圖1 酶解后瓊脂糖凝膠電泳圖注：M為DNA分子量標(biāo)記；1、4為GG基因型，2、8為CG基因型，3、5、6、7為CC基因型。

圖2 GG、CC基因型的測序圖譜注：箭頭所指為多態(tài)性位點(diǎn)，三角形所指為酶切位點(diǎn)。

1.3 觀察指標(biāo) 體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，餐后2 h血糖(two hour postprandial plasma glucose，2 hPG)，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.4 檢測方法 應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血糖和血脂變化，用親和層析法測HbA1c。應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血糖和血脂變化，采用終點(diǎn)法進(jìn)行檢測，終點(diǎn)法(Endessay)完全被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，不再進(jìn)行反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)，取反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度來計(jì)算血糖和血脂的濃度。生化檢驗(yàn)中除酶和BUN、CRE外幾乎都用終點(diǎn)法來進(jìn)行檢測。(1)一點(diǎn)終點(diǎn)法：取反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)時的一個點(diǎn)的吸光度來計(jì)算結(jié)果；(2)二點(diǎn)終點(diǎn)法：取反應(yīng)尚未開始時讀取一個點(diǎn)的吸光度，待反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)時再取第二點(diǎn)的吸光度。用第二點(diǎn)吸光度減去第一點(diǎn)吸光度的差值來計(jì)算結(jié)果。主要用于扣除試劑和樣品空白。保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般雙試劑用。利用親和層析法測HbA1c，將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘海淖兘Y(jié)合條件，將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，利用共價連接有特異配體的層析介質(zhì)分離蛋白質(zhì)混合物中能特異結(jié)合配體的目的蛋白或其他分子。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPN0組和DPN組患者的生化指標(biāo)和臨床資料比較 兩組患者在臨床資料及各種生化指標(biāo)方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 DPN0組和DPN組患者的臨床資料比較(±s)

表1 DPN0組和DPN組患者的臨床資料比較(±s)

注：1 mmHg=0.133kPa。

指標(biāo)DPN0組DPN組t值P值63/62 56.38±14.91 5.58±4.99 23.45±3.53 142.38±20.82 8.92±3.24 81.84±12.77 14.68±5.51 9.65±2.74 4.99±1.63 2.36±2.49 2.67±0.99 1.08±0.38性別(男/女，例)年齡(歲)病程(年) BMI(kg/m2) SBP(mmHg) FPG(mmol/L) DBP(mmHg) 2 hPG(mmo1/L) HbA1c(%) CHOL(mg/mL) TG(mmo1/L) LDL-C(mmo1/L) HDL-C(mmo1/L) 37/46 60.82±15.11 6.15±5.08 23.54±4.06 141.57±22.14 8.76±3.38 81.7±12.66 14.7±5.2 9.79±2.97 5.12±2.09 2.29±3.01 2.42±0.94 0.99±0.3 0.12 0.45 0.56 0.12 0.45 0.72 0.95 0.43 0.85 0.43 0.96 0.12 0.19＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

2.2 各組間基因型頻率和等位基因頻率比較 DPN0組的GG基因型頻率明顯高于NC組(χ2= 8.699，P=0.013；χ2=7.941，P=0.019)，DPN組和NC組的GG基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.766，P= 0.381)。DPN0組、DPN組的G等位基因頻率都明顯高于NC組(χ2=7.519，P=0.006；χ2=5.426，P=0.02；χ2=8.404，P=0.004)，但DPN0和DPN兩組間G等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.033，P=0.855)，見表2。

表2 各組IL-6基因頻率和等位基因[例(%)]

3 討論

DPN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，對患者生活質(zhì)量影響頗大。隨著人口老齡化的加重，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病率逐步升高，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病率也急劇升高[3]。國外研究報道DPN發(fā)病率隨年齡和病程增加，T2DM病程到達(dá)25年后周圍神經(jīng)病變的發(fā)生率可達(dá)50%以上[4]。國內(nèi)外報道糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)病率的不同，與其診斷標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)關(guān)系[5]，肌電圖是糖尿病周圍神經(jīng)病變診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其僅反映有髓鞘的大神經(jīng)纖維的功能狀態(tài)，而神經(jīng)末梢和小纖維改變常是糖尿病周圍神經(jīng)病變的早期改變，因此單獨(dú)使用金標(biāo)準(zhǔn)時，常可遺漏部分患者。

糖尿病周圍神經(jīng)病變病理改變主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)的脫髓鞘和或軸索變性。發(fā)病機(jī)制涉及多個方面：缺血缺氧、糖基化終產(chǎn)物的增多和氧自由基過多等。張媚等[6]研究發(fā)現(xiàn)用糖基化終產(chǎn)物對雪旺細(xì)胞體外干預(yù)，其干預(yù)組雪旺細(xì)胞增殖遷移能力減弱，凋亡增加，并且該組中TNF-α、IL-6水平明顯高于空白對照組及牛血清清蛋白組，初步提示雪旺細(xì)胞的損害可能通過促炎癥細(xì)胞的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。焦洋等[7]發(fā)現(xiàn)炎癥因子與糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生有關(guān)，其通過抑制IL-6等炎癥因子的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)。糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)生與促炎性細(xì)胞因子有關(guān)，對糖尿病周圍神經(jīng)病變進(jìn)展性的患者進(jìn)行腓腸神經(jīng)活檢，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的大多數(shù)基因表達(dá)均上調(diào)[8]。因此，炎癥和氧化應(yīng)激的病理生理變化在糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。糖尿病發(fā)生時，血糖升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，NF-кB活性增強(qiáng)，ROS增多，從而產(chǎn)生一系列促炎癥反應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)放大的惡性循環(huán)。

Kitamura等[9]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)單核細(xì)胞，IL-6基因型及等位基因不同，IL-6含量及分泌能力也有所差異，其中GG基因型、G等位基因攜帶者在體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞IL-6含量及分泌能力均明顯增加。國內(nèi)學(xué)者對于IL-6在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展中的作用的研究結(jié)果都存在差異，不同藥物治療前后IL-6的變化也存在差異。張麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在DM和DPN組較健康對照組均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，IL-6在DM組和DPN組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，阮園等[11]的研究與張麗等[10]相似。宋慶芳等[12]研究提示：IL-6是導(dǎo)致糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生的危險因素，而在糖尿病周圍神經(jīng)病變治療中，采用度洛西汀和甲鈷胺聯(lián)合治療糖尿病痛性神經(jīng)病變，治療后，測定IL-6水平明顯低于治療前[13]，而前列腺素E1治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。

本研究顯示：DPN0組和DM組的G/G基因型頻率均明顯高于NC組，而DPN組和NC組的G/G基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明IL-6基因啟動子區(qū)-634G/G基因型與糖尿病的發(fā)生有關(guān)，與糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生無明顯聯(lián)系。DPN0組、DPN組及DM組的G等位基因頻率均明顯高于NC組，但DPN0和DPN兩組間G等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明G等位基因與糖尿病及糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生均有關(guān)系，但在糖尿病進(jìn)展為糖尿病周圍神經(jīng)病變的過程中作用不大。IL-6及基因多態(tài)性對糖尿病周圍神經(jīng)病變影響的精確機(jī)理并不十分清楚，尚待深入探討。

[1]中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.中國2型糖尿病防治指南2013年版[J].中華糖尿病雜志,2014,6(7):447-498.

[2]Candrilli SD,Davis KL,Kan HJ,et al.Prevalence and the associated burden of illness of symptoms of diabetic peripheral neuropathy and diabetic retinopathy[J].J Diab Complic,2007,21(5):306-314.

[3]Albers JW,HermanWH,Pop-Busui R,et al.Effect of prior intensive insulin treatment during the Diabetes Control and Complications Trial(DCCT)on peripheral neuropathy in type 1 diabetes during The Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications(EDIC) Study[J].Diabetes Care,2010,33(5):1090-1096.

[4]Callaghan BC,Cheng HT,Stables CL,et al.Diabetic neuropathy clinical manifestations and current treatments[J].Lancet Neurol,2012, 11(6):521-534.

[5]史平平,傅松波,韋性麗,等.糖尿病神經(jīng)病變的診斷方法[J].中國老年學(xué)雜志,2014,34(18):5327-5329.

[6]張媚,張臨洪.糖基化終產(chǎn)物對雪旺細(xì)胞體外功能的影響及其機(jī)制的研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(5C):1729-1732.

[7]焦洋,于洋,李波,等.氫氣抑制核因子-κB通路對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2013,13(9):772-777.

[8]Hur J,Sullivan KA,Pande M,et al.The identification of gene expression profiles associated with progression of human diabetic neuropathy[J].Brain,2011,134(Pt 11):3222-3235.

[9]Kitamura A,Hasegawa G,Obayashi H,et al.Interleukin-6 polymorphism(-634 C/G)in the promotor region and the progression of diabetic nephropathy in Type 2 diabetes[J].Diabetes med,2002,19 (12):1000-1005.

[10]張麗,陸穎理,王國興,等.TNF-α、IL-6與糖尿病神經(jīng)病變的相關(guān)性及PGE1療效的觀察[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育,2006,4(1):32-34.

[11]阮園,謝曉競,馬建華,等.2型糖尿病神經(jīng)病變患者血清IL-6、8-iso-PGF2α檢測及意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(16): 3138-3140.

[12]宋慶芳,安旭娜,王戰(zhàn)建.血清游離脂肪酸TNF-α及IL-6與2型糖尿病神經(jīng)病變的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥,2013,35(12):1787-1789.

[13]甄燕,高素紅,武春林,等.度洛西汀聯(lián)合甲鈷胺治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的療效及對患者血清BDNF、IL-6水平的影響[J].臨床合理用藥雜志,2015,8(4A):36-37.

Correlation between 634C/G polymorphism of IL-6 gene and diabetic peripheral neuropathy.

AN Xin-huan1, DING Jun-cai2,WU Yan-feng3,LIANG Gan-xiong1.1.Department of Endocrinology,the People s Hospital of Zhongshan City,Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA;2.Department of Pediatrics,the People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528400,Guangdong,CHINA;3.The Physical and Chemical Analysis and Testing Center of Beijing City,Beijing 100094,CHINA

Objective To investigate the association of IL-6 gene promoter region-643C/G polymorphism with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was applied to detect the polymorphism of IL-6 gene promoter region-634 C/G in 125 cases of type 2 diabetes mellitus without DPN(DPN0 group)and 83 cases of type 2 diabetes mellitus with DPN(DPN group),which were treated in our hospital from Jan.2014 to Jan.2015,as well as 101 normal controls(NC group).The relative clinical data, genotype frequency and allele frequency were compared between groups.Results The GG genotype frequency was significantly higher in DPN0 group than NC group(16.0%vs 4.0%,P＜0.05).The G allele frequency was significantly higher in DPN0 group(34.4%)and DPN group(33.1%)than NC group(22.3%),P＜0.05,with no statistically significant difference between DPN0 group and DPN group(P＞0.05).Conclusion The IL-6 promoter region-643G/G genotype is not a genetic risk factor of DPN development,and IL-6-634G allele may be one of the risk factors in DPN development.

IL-6;Gene;Promoter region;Polymorphism;Diabetic peripheral neuropathy(DPN)

R587.2

A

1003—6350（2016）15—2435—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.008

2016-03-15)

廣東省中山市科技局基金資助項(xiàng)目（編號：2006A035）

安新煥。E-mail：axh1998@sina.com